Earticle

2D-Gel 이미지간의 유사성을 기준으로 생물학적인 시료가 프로테옴 수준에서 유사성의 정도와 서로 다른 단백질 스팟을 파악해 낼 수 있다. 그러나 생물학적인 시료는 개체간 변화가 크고 2차원 전기영동장치의 재현성의 한계로 인하여 비교가 어려운 경우가 많고 의미 없는 차이점만 발견되는 경우 또한 비일비재하다. 이를 극복하기 위해서는 프로테옴 이미지간의 정렬을 통하여 정확한 비교가 가능하게 하여야한다. 본 연구에서는 이미지상의 단백질 스팟을 일일이 찾지 않고 여러 개의 원시 이미지를 동시에 정렬시키는 multiresolutionmultilevel algorithm을 활용하여 소프트웨어를 개발하였다. 또 이렇게 정렬된 이미지들이 서로 얼마나 유사한지 보여주는 Phylogenetic tree를 자동으로 생성시키는 소프트웨어를 개발 하였다. 이 방법을 이용하여 Fetal Alcohol Syndrome의 case와 control의 10개의 프로테옴 이미지에 대하여 클러스터링을 시도하였다. 이와 같이 2D-Gel 프로테옴 전체의 이미지를 비교하여 유사한 정도에 따라 모으는 클러스터링은 FAS 시료의 경우 case와 control 보다는 시료원의 외연적인 특징인 나 이 혹은 성별에 더 의하여 의존하는 것으로 나타났다.

Alignment of 2D-gel images of biological samples can visualize the difference of expression profiles and also inform us candidates of protein spots to be further analyzed. However, comparison of two proteome images between the case and control does not always successfully identify differentially expressed proteins because of sample-to-sample variation, poor reproducibility of 2D-gel electrophoresis and inconsistent electrophoresis conditions. Multiple alignment of 2D-gel image must be preceded before visualizing the difference of expression profiles or clustering proteome images. Thus, a software for the alignment of multiple 2D-Gel images and their clustering was developed by applying various algorithms and statistical methods. Microsoft Visual C++ was used to implement the algorithms in this work. Multiresolution-multilevel algorithm was found out to be suitable for fast alignment and for largely distorted images. Clustering of 10 different proteome images of Fetal Alcohol Syndrome, was carried out by implementing a k-means algorithm and it gave a phylogenetic tree of proteomic distance map of the samples. However, the phylogenetic tree does not discriminate the case and control. The whole image clustering shows that the proteomic distance is more dependent to age and sex.

Lactic acid bacteria were isolated from pig feces for probiotics. The six isolated strains were identified as Lactobacillus paracasei (Lp), Lactobacillus fermentum (Lf), Lactobacillus brevis (Lb), Lactobacillus plantarum (P1, P2), and Pediococcus pentosaceus (P3) by its sugar utilization, morphological and physiological characteristics. P1 was showed largest antibacterial inhibition zone among the isolated strains. It was against Salmonella gallinarum 25 mm, E. coli 20.5 mm, Staphylococcus aures 24 mm, and Pseudomonas aeruginosa 28 mm by inhibitory zone, respectively. Lf was showed hyper acid tolerance, 80% survival rate for 40 minutes, and P1, Lb showed hyper bile tolerance, 408%, 283% survival rate for 9 hrs, respectively. Therefore the Lf, P1, and P2 strains were expected to probiotics.

바이오디젤과 바이오디젤을 기반으로 생산된 neopentyl polyol ester (NPE)계 윤활유 베이스, 디젤유 윤활유와 석유디젤을 분석대상으로 하여 지렁이 (Eisenia fetida)를 이용한 독성시험을 수행하였다. OECD 207 규격에 근거하여 독성을 분석한 결과 바이오디젤과 NPE계 윤활유 베이스의 반수치사농도 (LC50) 값은 각각 2,450과 1,528 mg/kg dry weight of soil로서 두 물질은 독성이 적은 경독성 (slightly toxic) 물질인 것으로 판명되었다. 디젤유 윤활유와 석유디젤의 경우 반수치사농도(LC50) 값이 각각 500과 603 mg/kg로서 중등독성 (moderately toxic) 물질로 판정되었다.

Toxicity test for biodiesel (BD), biodiesel-derived neopentyl polyol ester (NPE) lubricant oil base, lubricant oil for diesel engine oil (LODE) and petroleum diesel (PD) was carried out using earthworm, Eisenia fefida. According to the method by OECD 207, the LC50 values of BD and NPE were estimated as 2,450 and 1,528 mg/kg, respectively, which indicate that these compounds are classified as slightly toxic compounds. The LC50 values of LODE and PD were estimated as 500 and 603 mg/kg, respectively, showing that theses compounds are evaluated as moderately toxic compounds.

인산화 과정은 serine, threonine, tyrosine에서 발생하는 생화학적 반응으로, 본 연구에서는 다양한 응용의 잠재능력이 있는 phosphoserine, phosphothreonine, phosphotyrosine에 대한 엡타머를 개발하였다. 우선 in vitro selection 방법에 의해 combinatorial chemistry로부터 얻어진 RNA library로부터 이들 phosphoamino acids와 친화도를 가지고 있는 엡타머를 찾아낼 수 있었다. 총 10번의 일련 과정을 통해 phosphoserine에 대해서 2.6 nM의 친화도를 가지고 있는 엡타머를 (SeA-06), phosphothreonine에 대해서는 2.7 nM의 친화도를 가지고 있는 엡타머 (TrA-18)를 찾아낼 수 있었고, 이들의 RNA 2차 구조를 각각 예측하여 보았다. 그러나 phosphotyrosine의 경우 짧은 길이의 엡타머가 selection됨으로 내부적으로 구조를 가지는 엡타머는 얻을 수 없었다. o-phosphoserine에 대한 항체가 기존에 보고가 되었으나 유사한 구조를 지닌 o-phosphothreonine에도 비슷한 활성을 보여 이들을 구분할 수 있는 리간드를 찾기 힘들었으나, 본 연구에서는 엡타머를 사용한 특이성 조사에서도 서로를 극명하게 구별할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같이 발굴된 엡타머를 사용하여 biochip이나 proteomics 분석 도구의 응용에 큰 기대효과를 제공할 수 있을 것이라 사료 된다.

Phosphorylation of amino acid residues in proteins, plays a major role in biological mechanism. Phosphorylation acts as a process regulating the protein activity in variable pathways such as metabolism, signal transduction and cell division. Therefore the development of ligands for phosphoamino acids are an important work for protein analysis and proteomics studies. In this study, RNA aptamers for o-phosphoserine, o-phosphothreonine and o-phosphotyrosine which appears frequently in nature were developed by in vitro evolution method. We could obtain similar sequences from random RNAs of 40 mer by SELEX method through 10 cycles. As result, the aptamers for o-phosphoserine and o-phosphothreonine among phosphoamino acids aptamers showed high affinity of Kd= 2.60 nM and 2.65 nM for their target molecules, respectively. In addition, these aptamers could be confirmed the high selectivity for their target.

불포화지방산의 생합성능이 뛰어나다고 알려진 Thraustochytrids 균주 중 26185를 대상으로 arachidonic acid (AA C20:4 n-6)를 포함하는 PUFA 생산에 관여하는 유전자의 하나로서 key enzyme인 desaturase를 보다 효율적이고 안정적인 방법으로 cloning한 후 결과물을 분석하였다. 이를 위해 실험균주인 26185 균주를 대상으로 효율적인 전체 nucleic acids 추출법을 개발하였으며 관련된 기법의 활용을 통해 일반적으로 활용이 가능한 효과적이 방법임을 확인하였다. 확보된 유전체를 통한 direct PCR의 결과물을 기존에 알려진 cDNA 합성방법에 의한 결과물과 비교하였을 때 동일한 결과물임을 확인하였다. 이는 Thraustochytrids 관련 균주로부터 지방산 생합성에 관련된 효소군을 탐색하는 방법이 cDNA 합성방법에 의하지 않고 보다 직접적으로 진행될 수 있음을 제안할 수 있는 하나의 결과물로 생각되어진다. 획득된 유전자를 같은 진핵세포인 P. pastoris를 숙주로 하여 유전자를 도입하고 활성을 재현성있게 규명함으로써 인공진화 혹은 재조합균체의 개발이 가능하다는 사실을 부분적으로 제시할 수 있었다.

Polyunsaturated fatty acids, that is PUFAs, are important constituents of membranes particularly found in the retina and central nervous system. In microorganism-based PUFAs biosynthesis, the genus Thraustochytrids is well evaluated for their potential as a promising candidate in the practical production of PUFAs, such as AA and DHA. In this study, we attempted to optimize a method of total nucleic acid extraction from this microorganism as a preliminary experiment. Using the extracted nucleic acid and degenerated primers for direct PCR, we isolated a Δ5 desaturase gene that contained 1320-nucleotide and encoded 439 amino acids. This gene exhibited an expected function, when expressed in P. pastoris in the presence of appropriate exogenous substrate, as an evidence for Δ5 desaturase activity (conversion of DGLA to AA). These results and information could provide a basis for the construction of engineered strains suitable for the practical production of PUFAs.

탈질화 균주인 Paracoccus denitrificans를 이용한 탈질화 공정에 있어서 탈질 효율의 증대를 위해 선행 연구를 바탕으로 화학적 permeabilization 처리 후 균주를 고정화시키는 방법을 이용하였다. 반응기는 이상적인 CSTR을 도입하여 free cell reactor와 immobilized cell reactor 그리고 permeabilized and immobilized cell reactor의 세 가지 형태의 실험을 실시하였으며, 탈질효율의 비교를 위해 M-M 식을 적용시켰다. 각 반응기의 체류시간에 따른 탈질 효과는 permeabilized and immobilized cell reactor가 가장 우수하였으며 또한 반응 평형에도 다른 두 반응기에 비해 빨리 도달하는 것으로 나타났다.

Removal of nitrogen compound from waste water is essential and often accomplished by biological process. Denitrification bacterium, Paracoccus denitrificans (KCTC 2350) is employed to estimate the denitrification ability and the characteristics. In the immobilized biological reactor system, the measurement of absolute amount of active strain in the reactor is comparatively difficult or impossible. In this study, a reactor was designed with the unwoven texture wrapped peep holed plastic tube to calculate the absolute amount of active strain by comparing the activity of the permeabilized and or immobilized reactor and the free cell reactor. The reactor system was continuous stirred tank reactor and the reaction rate of substrate consumption was assumed to satisfy the Michaelis-Menten equation. The effluent concentration of nitrate and nitrite was measured to estimate the apparent parameter of Michaelis-Menten equation. As a result, we found that the amount of immobilized active strain was figured out to be half of the total active strain in the reactor and the time required to be reached in the equilibrium state in the permeabilized and or immobilized reactor system was figured out to be shorter than that of the free cell reactor system.

물고기 기름을 구성하고 있는 15 종류 지방산에 대한 mol수와 가수분해 시간 사이의 함수관계를 대수함수식, S i =-α i ln(t) +β i로 나타내었다. 동일 가수분해 시간에서 각 지방산에 대한 대수함수식의 Si 값과 실측치 사이의 오차가 15 종류 지방산 모두에 대하여 5% 이내에 분포되었다. 각 지방산의 mol수 Si와 가수분해 시간 사이의 대수함수식으로부터 각 지방산에 대한 가수분해 반응속도를 지방산 mol 수의 지수함수 관계식, v i = γ i exp ( S i α i )로 유도하였다. 또한 유도된 Si와 t 사이의 함수관계식으로부터 물고기 기름을 구성하는 15 종류 지방산 각각에 대한 가수분해율을 분석하였다. 가수분해 시간 48시간에서 가수분해율이 70% 이상인 지방산은 C14:0, C16:0, C18:0, C16:1, C18:1(n-7) 및 C18:1(n-9)이였으며, 가수분해율이 40% 내지 60% 사이에 분포되어 있는 지방산은 C20:1, C22:1, C18:3, C18:4, C20:4 및 C20:5이였으며, 가수분해율이 30% 내외인 지방산은 C21:5와 C22:5이였으며, 20% 이하인 지방산은 C22:6이였다.

The functional relationship between the number of mole of an i-fatty acid (Si) included in fish oil and the hydrolysis time(t) was expressed as a mathematical model, S i =-α i ln(t) +β i . The average errors of calculated values on the basis of the measured values were distributed in the range of less than 5% for all the 15 fatty aids composing of fish oil. The equation of hydrolysis rate of each fatty acid was deduced as v i = γ i exp ( S i α i ) from the above-mentioned S i =-α i ln(t) +β i . Therefore the hydrolysis yields of fatty acids were analyzed using the equation of Si vs. t. The 15 fatty acids were categorized into 4 groups from the view point of hydrolysis yield. The hydrolysis yields of the first group, including C14:0, C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 (n-7) and C18:1 (n-9), were higher than 70% at 48 hr of hydrolysis. Those of the second group, C20:1, C22:1, C18:3, C20:4 and C20:5, were distributed from 40% to 60%, and third group were around 30%. The final group containing only C22:6 was very hard to be hydrolyzed and the yield was less than 20% at the same time.

본 연구는 장시간의 산업적인 연속 배양에서 문제가 되는 플라즈미드 불안정성을 극복하기 위해서 박테리오 파아지 람다를 벡터로 이용하였다. 또한, 벡터의 안정성과 생산성을 높이기 위해서 용균과 λ DNA 패키징이 결핍된 돌연변이 람다를 선별하였다. 이 돌연변이 람다는 온도 전환에 의해서 단백질이 생산되는 온도 민감성 돌연변이 cI 유전자를 가지고 있기 때문에 재조합 단백질 생산, λ DNA 복제, 숙주 세포의 안정성 등이 lytic 상태로의 전환을 유도하는 온도에 영향을 받게 된다. 36℃의 배양 온도는 lytic으로 전환이 잘 되지 않았고, 40℃ 이상의 배양 온도는 완전한 lytic 상태를 유도하였다. 그러나 42℃의 배양 온도에서는 생산성이 감소되는 온도 저해 효과가 관찰되었다. 온도가 증가 할수록 박테리오파아지가 들어 있지 않는 대장균의 수는 증가하였고, 이것은 새로운 파아지를 만들 수 있는 박테리오 파이지를 사용하여 재감염을 시키면 완화될 수 있을 것으로 예상된다. 결과적으로 단위 세포당 발현량은 40℃에서 최대를 나타내었고, 안정성이나 총 발현량의 관점에서는 38℃가 최적의 온도로 관찰되었다.

E. coli in combination with bacteriophage λ was used to overcome the intrinsic plasmid instability that is frequently found in recombinant fermentation especially in long-term operation. In order to enhance the stability and productivity, the bacteriophage λNM1070 was used in this study. It is a λ mutant, which is deficient in the synthesis of protein related to DNA packaging and cell lysis. The λNM1070 is also a temperature-sensitive mutant. To optimize the production of recombinant protein in this temperature-sensitive system, the temperature effects on growth and cloned gene expression were investigated for stable and efficient recombinant gene expression. The induction to the lytic state was not complete at 36℃ while the temperature above 40℃ induced the lytic state completely. However, the productivity was decreased at 42℃ by temperature inhibition. The λ-free cell concentration increased with the increase of temperature until 40℃. In conclusion, λ NM1070 has the optimal temperature at 38°C for stability and at 40°C for expression.

The feasibility of using bacterial cultures with the ultimate aim for the marine environmental clean-up was explored. The present study reports on the bacterial elimination of nitrogens and phosphorus by strains CK-10 and CK-13 isolated from shrimp farming pond. The strains were identified as genus Bacillus on the basis of BIOLOG test, and designated as Bacillus sp. CK-10 and Bacillus sp. CK-13, respectively. Removal of nitrogens (NH4 +, NO2 -, or NO3-) or phosphorus (PO4 -3) as single N or P source was studied with single cultures under aerobic conditions. Complete elimination of all nitrogens in the concentration range of 100-400 μM was achieved in single cultures as well as co-cultures within the given incubation period. Similar results were obtained from the test cultures containing 125-599 μM PO4 3-. Simultaneous removal of all N/P was monitored in the co-cultures. As the results, 400 μM NH4 + and NO2 - were eliminated within 12 hrs and 400μM NO3 - and 500 μM PO4 -3 were completely disappeared within 36 hrs from the media. The work demonstrated that co-cultures improved the concurrent removal of N/P from the media.

효율적인 바이오칩을 개발을 위해 칩 표면에 생체 물질들의 상호반응이 효과적으로 일어날 수 있는 센싱 표면의 조성과 항원-항체반응과 같은 생체 인식반응을 정량적 신호로 전환하는 방법에 대해 연구하였다. 전기화학식 센서의 표면을 개선하기 위해 폴리아미도아민 덴드리머를 가교 물질로 도입하였다. 생체 분자들의 인식작용을 정량적인 신호로 전환하기 위해 전형적인 면역조직화학분석에서 사용된 반응들을 바이오센서에 적용한 방법론을 사용하였다. 효소에 의해 촉매되는 신호화 방법은 면역반응들에 대하여 광학식 센서와 전기화학식 센서에서 공히 수행되었으며, 매우 정량적인 신호로 측정되었다. 측정된 신호들로부터 단백질 농도에 비례하는 검량곡선을 획득할 수 있었으며 다양한 면역 샘플에 대한 적용 가능성을 제시하였다.

We have addressed two important issues of immunosensing biochips, including the construction of antibody functionalized surface for efficient affinity reactions and the development of a signal registration strategy that converts biospecific reactions into highly quantifiable electrochemical and/or optical signals. The developed immunoassay reaction is an integrated version of enzyme-mediated immunoprecipitaion reaction, which is widely used in immunohistochemistry, and electrochemical signaling reaction. For the evaluation of analytical performance of fabricated immunosensing biochips, signaling for mouse IgG in antiserum was conducted. Applications of the developed strategy have been found for the evaluation of histology chemicals and for the signal amplification for array-type biochip analysis.

본 연구는 헛개열매 추출물의 pH를 산성으로 조절한 산가수분해 방법에 의하여 헛개열매 추출물에 배당체 형태로 존재하는 알코올분해 효능을 가진 생리활성물질 ((+)-dihydromyricetin)의 양을 증가시켰다. 반응온도 80℃, 반응시간 4 hr, 반응 pH 2.0에서 124%의 알코올분해 효능이 증가하여 최적임을 알 수 있었다. 산 가수분해 전 후에 생리활성물질인 (+)-dihydromyricetin의 양이 30% 증가함을 알수 있었으며, 또한 헛개열매 추출물에 포함되어 있는 고분자 물질이 분해됨을 확인할 수 있었다.

This work was a method that used an acid hydrolysis for increasing the efficacy of decreasing alcohol concentration from Hovenia dulcis extract. For acid hydrolysis, the best pH was 2.0 to obtain a maximum alcohol dehydrogenase activity at fixed reaction temperature and time. At pH 2.0, reaction temperature 80℃ and reaction time 4 hr gave the highest activity which was 124% of control. The bioactive compound, (+)-dihydromyricetin, content increased to 30% after acid hydrolysis. This is very simple and efficient method to increase the efficacy of decreasing alcohol concentration from Hovenia dulcis extract.