Earticle

천연 식품 소재로 널리 사용되는 효모 추출물을 제조하는 공정의 개선을 위하여 제빵용 효모를 이용하여 자기소화법과 효소처리법을 병용하여 효모 추출물을 제조하였다. NaCl과 에탄올이 효모의 자기소화에 영향을 미치는 인자이었으며 최적 첨가량은 각각 3%와 1%이었다. 효모의 열처리와 효모 세포벽 분해효소의 사용은 유의하지 않았다. 효모를 자기소화 시킨 후 단백질 분해효소와 핵산 분해효소를 처리하고 Maillard 반응과 debittering 공정을 거쳐 효모 추출물을 제조하였다. 최종적으로 얻어진 효모 추출물의 수율은 고형분 기준으로 76%, 총 질소 기준으로 59%이었다. 맥주 효모를 이용한 결과와 비교하면 제빵용 효모를 이용하는 것이 맥주 효모를 이용하는 것보다 수율면에서도 유리하였다.

A combined method of autolysis and enzymatic hydrolysis of baker´s yeast was developed for the production of yeast extract, which is widely used as a natural food ingredient. From statistical analysis, NaCl and ethanol addition were found to be significantly effective factors in autolysis of yeast. The optimum dosages of salt and ethanol were 3% and 1%, respectively. Heat treatment and the use of cell lytic enzyme were not significantly effecting on the autolysis. Yeast hydrolysate was prepared by autolysis, followed by enzymatic hydrolysis using proteases, nuclease and deaminase. Additionally, the hydrolysate was processed by downstream process including Maillard reaction and debittering. The total dry matter yield and total nitrogen yield for the process were 76% and 59%, respectively. Compared to a process using brewer´s yeast, when baker´s yeast was used as a raw material, a higher recovery yield was obtained.

본 연구에서는 C형 인지질 분해효소 (PLC)를 생산하는 것으로 알려진 각종 B. cereus (B. cereus 11, 318, 559 와 B.cereus ATCC10987)의 배양을 통해 미생물의 성장과 PLC의 생산 특성을 조사하였다. 특히, LB 배지에서 최대 PLC 생산(85 units/mL) 특성을 보인 B. cereus 318를 이용하여 균체성장 및 PLC 생산에 적합한 배양 배지를 조사하였다. 탄소원으로는 glucose, 질소원으로는 yeast extract와 peptone, 인산과 아연의 농도는 각각 0.5～1 g/L과 0.02～0.04 g/L이 PLC의 생산을 최대로 할 수 있는 적합한 배양액의 조성인 것으로 나타났다. 또한, B. cereus를 이용하여 PLC를 생산할 때 배양온도는 30℃, 배양액의 pH는 7.5로 배양하는 것이 균체성장 및 PLC 생산에 효율적임을 알 수 있었다. 한편, B. cereus에 의해 생산된 PLC의 반응 특성을 연구하였는데, B. cereus 11과 318에 의해 생산된 PLC는 45℃, pH 4에서 최대 활성을 보였고, B. cereus 559에서 생산된 PLC는 50℃, pH 7에서 최대 활성을 나타냈다. B. cereus에서 생산된 PLC에 망간 이온, 코발트 이온 그리고 DMSO가 첨가되었을 때는 PLC의 활성이 상당히 증가했고, 구리 이온, glycerol, isopropanol 과 SDS 등을 첨가했을 때는 PLC 활성이 감소함을 볼 수 있었다.

In this work we have cultivated several B. cereus strains in a complex LB medium in order to study the production of phospholipase C (PLC), and among them B. cereus 318 showed the highest productivity of PLC. Some components, i.e., 5 g/L glucose, 5 g/L yeast extract, 5 g/L peptone, 0.5～1.0 g/L K2HPO4, 0.02～0.04 g/L ZnSO4․7H2O and 3 g/L NaHCO3 were found to be optimal for the high production of PLC by B. cereus 318. Optimal culture temperature and pH were found to be 30℃ and pH 7.5 for the PLC production, respectively. Optimum reaction temperature and pH of the PLC produced by B. cereus 11 and 318 were 45℃ and pH 4.0, while they were 50℃ and pH 7.0 for the PLC by B. cereus 559. The PLC produced by B. cereus was activated by Mn2+, Co2+ and dimethyl sulfoxide (DMSO), but its activity was inhibited by Cu2+ and partially by glycerol, isopropanol and sodium dodecyl sulfate (SDS).

최근, 미세조류에 대한 생물공학적 관심이 급격히 증가하고 있으며 이의 응용범위는 식품이나 제약, 화장품 등 다양한 구도로 확장되어지고 있다. 고농도의 미세조류 배양을 위해서는 빛이 핵심적 제한요소로 작용되어지며 빛의 투과 깊이나 강도에 따라 균체의 성장속도가 결정되어지게 된다. 본 연구에서는 다양한 빛의 투과경로와 빛을 받는 면적/배양액의 부피 비율, 조도 그리고 단계적 조사에 따른 hlorella sp.의 성장률을 조사하여 빛이 미세조류에 미치는 영향을 알아 보았으며, 본 연구에 적용된 값들 중 4 cm의 직경, 57.6%의 면적/부피 비율, 62 μmol/m2/s의 조도에서 Chlorella sp. 성장에 필요한 빛 에너지를 가장 효율적으로 이용함을 확인할 수 있었다.

Recently, there is a growing interest in microalgae and the use of microalgae focused on the production of various high value metabolite used in food, pharmaceuticals and cosmetics. The key limiting factor in high density algal cultivation is the light and algal growth is defined by light intensity and light penetration depth into the culture medium. The effect of light with various light paths, S/V ratios, light intensities, and 50% duty cycle on the growth of microalgae was examined to enhance microalgal biomass productivity and photosynthetic efficiency. We confirmed that the utilization of efficient light energy was obtained from 4 cm of diameter, 57.6% of S/V ratio, 62 μmol/m2/s of light intensity .

최근 생체 내에서 다른 약리활성을 보이는 키랄물질의 고순도 제조에 관심이 증가되고 있다. 현재 널리 사용되고 있는 것은 키랄고정상을 이용한 기존 분리방법에 비해서, 제조 후 안정성과 환경적인 측면을 고려한 초임계유체를 이용한 분리방을 시도하였다. 본 연구에서는 키랄물질인 ibuprofen의 최적의 분리 조건을 구하기 위해서 온도와 압력, 첨가되는 IPA의 양에 따른 체류인자와 분리도의 영향을 고찰하였다. 온도가 감소하고 압력이 증가할수록 체류인자는 감소하였다. IPA의 양에 따라 더 큰 영향을 받아서 IPA의 양이 많을수록 분리도는 감소하는 경향을 보였다. 실험으로부터 정한 최적의 분리조건은 130 bar, 311.15 K, 4% IPA (vol.)일 때이었다. 동일한 주입량에서 액체 크로마토그래피에서는 비선형의 용출곡선을 보였지만, 초임계유체 크로마토그래피에서는 선형의 용출곡선을 얻었다.

The separation method using chiral stationary phase in preparation of chiral compound was wildly used, but in this work, supercritical fluid chromatography was suggested in the stability to resolve the chiral mixtures. To determine the optimum operating condition of the racemic ibuprofen, the retention factor and resolution with change in pressures, temperatures and the contents of IPA % (vol.) in CO2 were investigated. The retention factor was decreased with increase in pressure and decrease in temperature. The factor was also influenced by the content of IPA in mobile phase, while the resolution was worse with a increase in IPA %. From the experimental results, the desirable separation condition was 130 bar, 311.15 K and 4% IPA in CO2. Compared to the asymmetric peak shape by liquid chromatography, that of supercritical fluid chromatography was symmetric which was a favorable condition for preparative separation.

TLC와 microwave 오븐을 이용하여 여러 가지 분자량의 당들의 농도, 그리고 구조에 따른 보정인자값 {보정인자값 (F) = [각 당의 실험적 중합도/각 당의 실질적 중합도], 여기서 실험적 중합도 = [실험에서 얻은 총 당량의 농도에 따른 변화율/실험에서 얻은 환원당량의 농도에 따른 변화율]}을 결정하였다. 플락토오스의 경우 0.25∼1.0 ㎍ 농도를 TLC에 점적한 경우에는 보정인자값이 약 0.45로 일정하였고, 2.5∼7.5 ㎍인 경우에는 1.0 이었다. 글루코오스의 경우는 0.25∼7.5 ㎍의 농도 구간에서 1.0으로 같은 값이 확인되었다. 말토올리고당과 이소말토올리고당 혼합물은 0.5∼7.5 ㎍ 농도의 구간에서 보정인자값이 글루코오스를 1.0으로 하여 중합도가 커질수록 말토헵토오스와 이소말토 펜타오스까지 일정하게 감소하는 것을 확인하고 그 값을 정해주었다. 또한 새로운 구조의 탄수화물의 환원성과 비환원성 여부를 TLC상에서 쉽게 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구로부터 얻은 결과는 다수의 탄수화물들이 한 가지 시료에 섞여 있는 경우에도 각 구성 당의 실제적 중합도를 아는 경우 절대적 당량을 계산할 수 있고, 탄수화물들 중 환원성 당과 비환원성 당의 구별에 쉽게 활용할 수 있겠다.

A simple, fast and reproducible quantitative analysis method for sugar concentration composed in oligosaccharide mixture was developed. Two glass TLC plates were prepared per sample. After dipping one plate into the copper bicinchoninate reagent and the other plate into 5% sulfuric acid solution, both plates were baked in microwave oven until sugar spots were developed or the surface temperature of TLC plate becomes 60 to 70 °C. The corrective factor values [F value = (the value of total sugar concentration converted as glucose unit/the value of reducing sugar concentration converted as glucose unit)/(polymerization degree of sugar)] of different molecular weight sugars were determined. Within the concentration of 0.25∼1.0 ㎍ in each sample loaded, the fructose-F (corrective factor value of fructose) was 0.45, yet for the higher concentration (2.5∼7.5 ㎍) fructose-F was 1.0. In case of glucose, in the range of 0.5∼7.5 ㎍, glucose-F was same as fructose-F, 1.0. However, as the molecular weight of sugar was increased, the F values were decreased in both maltodextrin and isomaltodextrin oligosaccharides in 0.5∼7.5 ㎍ of each sample loaded. Interestingly, F values were equal for the same molecular weight sugars, although the structures were different from each other. Using F value of each sugar, we could determine and compare the exact total sugar concentration of different molecular weight maltooligosaccharide and isomaltooligosaccharide. We also could determine if the unknown sugar was a reducing or non-reducing compound by using optimized TLC with microwave oven method.

한국산 지렁이 (Lumbricus rubellus) 분쇄액으로부터 연속적인 column chromatography로 6종의 lumbrokinase (LK) fractions를 얻었다. 여섯 종의 LK fractions의 분자량은 24.6~33.1 kDa 사이였다. rat venous thrombosis를 이용한 실험모델에서, LK분획을 oral administration한 쥐에서 thrombus 중량은 유의하게 감소하였고, APTT, PT와 plasmin 활성도 유의하게 증가하였고, PAI activity도 유의하게 감소하였다. rat platelets를 LK 분획으로 전 처리하였을 때에 thrombin에 의한 응고는 억제되었고, MDA 생산도 감소되었다. 쥐의 흉대동맥과 장간막동맥을 phenylephrine으로 수축을 시킨 후에 LK 분획을 각각 처리하였을 때에 혈관이 이완되었다. 상기의 결과는 LK분획이 fibrinolytic activity 뿐만 아니라 platelet 응집의 억제와 혈관의 이완작용에도 영향을 준다는 것을 의미한다. 결론적으로 LK는 fibrin clot치료를 위한 hemolytic agent로서 유용하다고 판단한다. 2-아릴프로피온산 계열의 키랄 의약품의 효소적 dynamic kinetic resolution (DKR) 공정에서 라세미화 염기촉매로 트리 옥틸아민이 지금까지 주로 사용되어 왔으나 반응매질에 녹은 상태로 작용해 회수 및 재사용이 어려웠다. 본 연구에서는 이를 개선하고자 라세미화 반응을 위한 고효율 고체 염기를 탐색해 보았다. 45°C, 아이소옥탄 내에서 (S)-나프록센 2,2,2-트리플로로에틸 씨오에스터를 기질로 무기 염기류, 염기성 음이온교환수지류, resin-bound 염기류 등을 시험한 결과, 약 염기성 음이온교환수지인 DIAION WA30을 사용하였을 때 가장 효과적이었다. DIAION WA30의 2차 interconversion constant (k*int)는 8.6×10-4 mM-1h-1이며 동일한 실험조건 하에서 수행한 트리옥틸아민 (k*int = 2.5×10-4 mM-1h-1)에 비해 약 3배가 높았다. 효소 활성에 필수적인 물의 양에 따른 DIAION WA30의 라세미화 효율에 관하여 실험한 결과, 물의 양이 증가할수록 그 효율은 감소하였다. DIAION WA30을 라세미화 촉매로 사용하여 아이소옥탄 내에서 라세믹 나프록센 2,2,2-트리플로로에 틸 씨오에스터의 효소적 DKR 반응을 수행해 보았다. 그 결과 DIAION WA30을 사용하지 않은 경우에 비해 반응 전환율과 생성물의 광학 순도는 급격히 향상되었다. 전통적 광학분할 반응의 최대 50%라는 전환율의 제한이 본 연구에서 찾은 DIAION WA30을 첨가함으로써 성공적으로 극복되었다. 또한 고체 염기촉매인 DIAION WA30의 사용은 라세미화 촉매의 회수 및 재사용이 가능하게 해준다.

Six lumbrokinase (LK) fractions from Lumbricus rubellus lysates were purified by a series of column chromatographies. The molecular weights of the six LK fractions appeared to range from 24.6 to 33.1 kDa. In the experimental model of rat venous thrombosis, the thrombus weight and PAI activity decreased significantly when the LK was administered orally. However, the activities of APTT, PT and plasmin showed a significant increase. The aggregation of rat platelets pretreated with various LK doses was inhibited by thrombin, and the MDA generation decreased. The rat thoracic aorta and mesentric arteries contracted with phenylephrine relaxed due to the treatment of the LK fractions. These results suggest that the fibrinolytic effects of LK were mediated not only by proteolytic activity, but also by the inhibition of platelet agregation and the relaxation of blood vessels. It is concluded that the LK may be useful as a hemolytic agent for treatment of fibrin clot.

초임계 이산화탄소를 이용하여 가시오갈피로부터 유용성 분인 acanthoside-D를 추출하여 다음과 같은 결론을 유추하였다. 에탄올과 물, 그리고 50% 메탄올을 공용매로 사용하여 일정압력과 온도에서 추출한 결과물에서의 수율이 가장 높게 측정되었으며, 압력의 변화에 따른 acanthoside-D의 추출효율을 비교한 결과 300 bar에서 가장 높은 추출효율을 나타내었다. 또한 50% 메탄올을 공용매로 하여 유량을 변화시킨 결과, 높은 유량에서 높은 수율을 나타내었으나 1.5ml/g 이상의 유량에서는 수율의 변화가 없었다.

The purpose of this study was to find an optimum extraction condition of acanthoside-D from acanthopanax cortex with supercritical carbon dioxide as a solvent. In this effort, effects of the extraction conditions including pressure, temperature and presence or absence of a cosolvent on the extraction efficiency were investigated. The ethanol, water or 50% methanol was used as a cosolvent whilst the operating pressure ranged from 200 bar to 300 bar. The acanthoside-D concentrations were determined by means of HPLC equipped with a UV detector. From the results, it was observed that increase of higher pressure led to the higher extraction efficiency. Further, water was found to be the best cosolvent among the entrainers tested.

효모의 종류에 따라 세포벽의 composition이 다른 것으로 알려져 있으나 이에 대한 체계적인 연구는 아직 이루어지지 않고 있다. 본 연구에서는 한국 유전자은행 (KCTC)과 한국 미생물 보존센터 (KCCM)에서 구입한 15종류의 효모를 Glucanex® 200G로 처리한 후 생균수를 측정하여 상대적인 저항성을 비교하였다. 그 결과 Trigonopsis variabilis나 Sporidiobolus pararoseus는 β-glucanase에 대한 저항성이 높았으며 Pichia stiptis나 Filibasidium capsuligenum은 β-glucanase에 대한 저항성이 낮았다. β-glucan의 함량이 높은 세포는 높은 농도의 β-glucanase 농도에서도 저항성을 가지므로 이를 바탕으로 여러 효모의 세포벽의 상대적인 β-glucan 함량을 추정할 수 있다.

The cell wall of fifteen yeast strains were treated with Glucanex® 200G that contained mainly β1,3-glucanase and some β 1,6-glucanase. In our previous study it was found that the yeasts that are more resistant to Glucanex® 200G treatment contained more β-glucan than the yeasts that are less resistant to Glucanex® 200G treatment. By measuring the resistance of cell wall to Glucanex® 200G, the relative content of β-glucan in yeast cell wall could be estimated. The resistance of cell wall to Glucanex® 200G was measured by counting viable cell number after reaction with and without Glucanex® 200G. The resistance of fifteen yeast strains to Glucanex® 200G were presented.

박테리오신의 일종인 leucocin A로 형질전환된 효모가 보이는, B. subtilis에 대한 항균 활성을 파악하기 위하여 형질 전환되지 않은 효모와 형질전환된 효모를 배양하면서 시간별로 채취하여 광학밀도, 건조중량, 총단백질량, 단백질 분해효소 그리고 항균활성을 측정하였다. Leucocin A의 항균활성은 성장양상과 비례하였다. 배양초기에 비해 12시간 배양 후에 항균활성이 3배 이상 증가하는 것으로 나타났고, 이때 B.subtilis의 성장이 70.57% 감소하는 것으로 나타났다. 정지기 이후에는 항균활성이 급속히 감소하였는데, 이는 항균활성을 보이는 leucocin A가 단백질이고, 단백질 분해효소가 정지기 이후 증가한 것에 의한 것으로 사료되었다. 이 연구는 향후 식품산업 등에 사용할 수 있는 bacteriocin의 산업적 생산에 필요한 기초자료를 제공할 수 있을 것이다.

The aim of this study was to figure out the antibacterial pattern of leucocin A transformed yeast with culture. Dry cell weight, total secreted protein, and antibacterial activity were increased to 12 hour, after then they showed decrease while protease activity represented the opposite pattern. This implied the production of leucocin A was growth-related. Compared to the result of one hour culture broth, antibacterial activity was about 3.24 fold at 12 hour culture. Maximum growth inhibition rate was 70.57% compared to nontransformed yeast. As the increase of protease in the supernatant, the antibacterial activity was diminished. This study could permit the mass production of bacteriocin to use as antibiotics or food preservatives.

해양유래미생물에서 gelatin 분해능이 우수한 균주 Vibrio vulnificus CYK 279H를 이용하여 최적 효소활성조건을 검토하였다. 온도와 초기 pH는 25℃, 7.5에서 높은 것으로 나타났으며, 단당, 이당, 다당류를 첨가하여 탄소원의 영향에서는, 0.3% (w/v) galactose 에서, 유․무기 질소원으로는 0.6% (w/v) yeast extract와 4.0% (w/v) gelatin, 0.2% (w/v) (NH4)2SO4에서 효소활성이 가장 높게 나타났다. 염 농도로 는 2.0% (w/v) NaCl, 금속이온은 Fe2+를 첨가하였을 때 효소활성이 증가되었다. 선정된 최적배양조건에서 Vibrio vulnificus CYK 279H를 배양한 결과, 18 h 배양시 73 Unit/l로 기본배지 20 Unit/l보다 활성이 3.7배 증가한 것으로 확인되었다.

A marine bacterium for producing an collagenolytic protease was isolated from the southern sea of Korea and identified as Vibrio vulnificus and named as Vibrio vulnificus CYK279H. This strain producing an collagenolytic protease was showed high activity toward collagen and gelatin as substrate. The optimum initial pH, NaCl, and temperature for cell growth and protease production was 7.5, 2.0% and 25℃, respectively. Optimization for collagenolytic protease production was composed of 0.3% D-galactose, 0.6% yeast extract, 4.0% gelatin, 0.2% (NH4)2SO4, and 0.2 mM ferric citrate in artificial sea water. The maximum protease production was required gelatin and yeast extract. The collagenolytic protease production by Vibrio vulnificus CYK279H reached a maximum of 73 unit/l after the cultivation for 18 h under the optimized medium.

한국 전통누룩으로부터 분리한 신종 Aspergillus coreanus NR 15-1가 생산하는 α-amylase의 효소학적 특성을 조사했다. 공시균주가 생산하는 α-amylase는 황산암모늄을 이용한 분별 침전, CM-cellulose, DEAE-cellulose, Sephadex G-100, hydroxyapatite column chromatography를 통하여 8.7%의 수율을 보이며, 78배로 정제되었다. 공시균주의 α-amylase의 분자량은 Sephadex G-100 겔 여과에 의해 49 kDa으로 나타났으며, SDS-PAGE에 의하여 51 kDa으로 측정되어 본 효소는 monomer로 추정할 수 있었다. 정제효소는 pH 4.0～11.0 사이에서 안정하였으며, 반응최적 pH는 5.0이었고, 50℃ 이하의 온도에서 비교적 안정하며, 반응최적온도는 45℃로 나타났다. 정제효소는 금속이온에 의해 효소활성에 영향을 받지 않았으나, N-bromosuccinimide에 의해서는 효소활성이 완전히 저해되어 본 공시균주의 α-amylase의 활성부위에는 tryptophan 잔기가 관여한다고 추정할 수 있었다. 정제효소의 전분분해물은 maltose, maltotriose 등의 oligosaccharide를 형성하므로 α-amylase임을 확인할 수 있었다. 신종 누룩시상균인 Aspergillus coreanus NR 15-1의 α-amylase는 50℃ 이하의 온도와 pH 4.0～11.0사이에서 안정하여 온도와 pH의 안정성이 우수하여 누룩제조용 사상균으로 사용이 가능함을 알 수 있었다.

The characteristics of the α-amylase of Aspergillus coreanus NR 15-1 isolated from traditional Korean Nuruk have been carried out. The α-amylase of A. coreanus NR 15-1 was purified by ammonium sulfate precipitation followed by column chromatographies on CM-cellulose, DEAE-cellulose, Sephadex G-100 gel filtration and hydroxyapatite. The α-amylase was purified 78-fold with a yield of 8.7％. The molecular weight of the α-amylase was estimated to be 49 kDa by Sephadex G-100 gel filtration and 51 kDa by SDS-polyacrylamide gel eletrophoresis. These experimental results suggested that the purified enzyme might be monomer. The enzyme was stable between pH 4 and 11. The optimum pH was 5.0. The optimum temperature for enzyme was 45℃ and the enzyme was stable up to 50℃. The enzyme was significantly inhibited by 1 mM N-bromosuccinimide. These results suggested that tryptophan residue was involved in the active site of α-amylase. The enzyme was identified as α-amylase because the reaction products of soluble starch hydrolyzed by the purified enzyme was oligosaccharide by thin layer chromatography.

모넨신, 니저리신, 사이클로스포린 등을 하이드록실레이션 시키는 균주인 S. benihana에 존재하는 여러 가지 CYP를 클로닝하기 위해, 방선균 CYP의 보존된 부분을 통해서 degenerate primer를 제작하였고, colony hybridization을 통해서 스크리닝 한 결과 총 5 종류의 CYP가 검색되었다. 아미노산 서열의 분석 결과 방선균의 CYP 들과 매우 높은 유사성을 가졌으며, 이들 CYP의 앞 뒤 서열의 검색 결과이 중 4개의 CYP의 downstream에는 FD 유전자가 존재함을 알 수 있었다. CYP503의 경우 다른 나머지 4개의 CYP의 서열과 차이가 많았으며, 2차 대사산물의 변형과 관련 되어 있을 것으로 예상되며, ChoP와 유사성을 보이는 나머지 4개의 CYP는 스테로이드 계열 물질의 하이드록실레이션과 밀접한 연관이 있을 것으로 추정된다.

A degenerate set of PCR primers based on two conserved regions (heme binding region and oxygen ligand pocket) were designed and successfully applied to amplify DNA fragments of cytochrome P450 hydroxylase (CYP) genes from a rare actinomycetes, S. benihana. The PCR amplified products were employed as a DNA probe to clone the entire CYP genes from S. benihana genomic library. Five different CYP-positive cosmids were isolated by colony hybridization as well as PCR confirmation. The complete nucleotide sequencing of five different CYP genes revealed that each unique CYP showed significant amino acid homology to previously-known CYP genes involved in streptomycetes secondary metabolism. In addition, four CYP genes (CYP502, CYP503, CYP504, CYP506) were found to be linked to ferredoxin genes in the chromosome, and the CYP503 gene showed the high degree of amino acid similarity to the previously well-characterized CYP105 family in streptomycetes.

본 연구에서는 환경호르몬 물질의 하나인 스티렌 다이머를 분해하는 미생물을 자연계로부터 분리하고자 하였다. 분리결과 스티렌 다이머 분해 능력이 있는 strain YH3를 분리하였다. Strain YH3은 단일균주가 아닌 3종류의 서로 다른 미생물상을 이루고 있었다. 동정을 한 결과 strain YH32는 Pseudomonas sp.로, strain YH33은 Klebsiella pneumoniae로 동정되었으나, strain YH31은 동정이 되지 않았다. 이들 세균주는 단일균 혹은 두 종류씩 짝을 지어 배양 하여도 스티렌 다이머를 분해하지 못하였으나 세 균주가 혼합되었을 때는 O.D660nm 값과 색도의 변화를 통해 생장을 확인 할 수 있었다. 세 균이 혼합된 복합균주 YH3을 대상으로 균주의 최적 생장 조건을 검토한 결과, 35℃, pH 7.0, 기질 농도 1,000ppm (v/v)으로 각각 조사되었다. 또한, 유기용매에 대한 내성은 복합균주 YH3는 logP 값이 3.1 이상에서 생장하였고, 방향족화합물인 ethyl benzene과 제초제의 일종인 2,4-D를 분해하였다. 그러나 benzene, toluene, xylene 및 styrene trimer는 분해가 어려운 것으로 확인되었다. 그리고 TLC 분석 결과, 배양 5일째부터 스티렌 다이머의 중간대사산물이 관찰되었다.

We examined the culture conditions and degrading characteristics of styrene dimer (endocrine disrupter) using microorganism. The isolated microbe were consisted of 3 kinds of strain. The strains were identified to Pseudomonas sp. and Klebsiella pneumoniae by API 20E kit, but one was not identified . Single strain was not grown on the C-medium containing styrene dimer. However the complex strain YH3 could grow and we confirmed it by the broth color and O.D660nm (optical density 660 nm). The optimal culture conditions of complex strain YH3 were 35℃, 1,000 ppm (v/v) of styrene dimer and pH 7.0, respectively. In tolerance test against the organic solvents, the complex strain YH3 could grow above log P= 3.1, and could degrade ethyl benzene and 2,4-D, one kind of herbicide. As a result of TLC (Thin Layer Chromatography) analysis, we confirmed that the metabolite of styrene dimer was created by YH3 after 5th day, but not at control samples.

본 연구에서는 초임계 이산화탄소를 이용한 SAS 공정을 난용성 약물인 이트라코나졸과 친수성 물질인 HP-β-CD의 포접복합체 미세입자의 제조에 적용하기 위한 기초 연구를 수행하였다. 이 트라코나졸과 HP-β-CD를 1:2의 몰비로 혼합한 용액을 사용하여 35～65℃의 온도범위와 83～140 bar의 압력범위에서 SAS 공정으로 이트라코나졸/HP-β-CD 포접복합체 미세입자를 제조하였으며, 이트라코나졸 및 HP-β-CD 원재료의 열적 특성과 비교함으로써 초임계 유체 공정에 의해 포접복합체를 제조할 수 있음을 확 인하였다. 또한, SAS 공정에 의해 제조된 이트라코나졸/HP-β-CD 포접복합체의 인공위액에 대한 이트라코나졸의 용출시험을 수행한 결과 이트라코나졸 원재료와 이트라코나졸을 함유한 대표적 시판 제제인 스포라녹스 캡슐제와 비교해 투입된 이트라코나졸의 50～80%에 해당하는 양이 용출개시 5분 만에 방출되는 매우 빠른 초기 용출특성을 보임을 확인할 수 있었다. 이트라코나졸/HP-β-CD 포접복합체의 제조시 SAS 공정 조건이 35℃에서 65℃로 높아짐에 따라 이트라코나졸의 용출률이 감소하였을 뿐만 아 니라 열분석 결과 이트라코나졸의 용융 피크의 세기도 점차로 증가하게 된다는 결과로부터 포접복합체의 형성이 이루어지는 주변 매질의 온도가 높아짐에 따라 초임계 이산화탄소 분자의 활동도가 증가하게 되어 이트라코나졸과 HP-β-CD 간의 포접복합체형성에 필요한 결합력이 점차로 약해져서 포접 효율이 저하하게 됨을 확인할 수 있었다.

Microparticles of an inclusion complex between itraconazole and 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) were prepared using an environmentally-benign supercritical anti-solvent (SAS) process. In order to evaluate the degree of complexation, the thermal behavior of solid microparticulate complexes was investigated using differential scanning calorimetry. The experimental results obatined for the solubility and dissolution rate of the microparticulate inclusion complexes in a buffer solution of pH1.2 showed that the complexation of itraconazole with HP-β-CD results in a significant increase in the solubility and dissolution rate of itraconazole. For the microparticulate itraconazole/HP-β-CD inclusion complexes prepared by the SAS process, about 80% of itraconazole was found to dissolve in the buffer solution. Our experimental results confirmed that the SAS process is a promising method for the preparation of microparticles of water-insoluble drug/cyclodextrin inclusion complexes.

Inducible system을 이용하여 (R)-hydroxybutyric acid (R3HB)를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. Ralstonia eutropha에서 유래한 PHB depolymerase 유전자를 inducible promoter에 의하여 발현되게 만들고, PHB 생합성 유전자가 있는 vector에 cloning하였다. PHB 생합성 유전자와 depolymerase 유전자를 가지고 있는 재조합 대장균을 배양하여 먼저 PHB를 축적시킨 후에 depolymerase를 발현시켜 배지 내로 분비된 R3HB를 확인하였다. 그 결과 축적된 PHB의 대부분은 발현된 depolymerase에 의하여 분해되었으며, depolymerase의 발현 이후에도 재조합 대장균은 PHB를 축적하고 분해하여 R3HB의 농도는 배양시간에 따라 증가하였다. 이러한 결과는 inducible depolymerase를 갖는 재조합 대장균을 이용하여 높은 농도의 R3HB를 얻을 수 있다는 것을 보여준다.

An inducible expression system of poly[(R)-3-hydroxybutyrate] (PHB) depolymerization was established in metabolically engineered Escherichia coli with the PHB biosynthesis genes. The Ralstonia eutropha PHB depolymerase gene was cloned in a vector system containing the PHB biosynthesis genes and expressed under inducible promoter. Recombinant E. coli harboring the PHB biosynthesis genes and depolymerase gene was first cultured for the accumulation of PHB, and then the depolymerase was expressed resulting in the degradation of accumulated PHB into (R)-3-hydroxybutyric acid (R3HB). R3HB could be produced with the concentration of 7.6 g/L in flask culture. Two different PHB biosynthesis genes from Alcaligenes latus and R. eutropha were compared for the production of R3HB. This strategy can be used for the production of enantiomerically pure (R)-hydroxycarboxylic acids with high concentration.

재조합 E. coli를 이용한 MCL-PHA의 생산에서 fatty acid pathway로부터 PHA 생합성 전구체 물질들이 만들어진다는 사실과 함께 이에 관여하는 enzymes이 밝혀지고 있다. 본 논문에서는 protein homology search로부터 탐색된 paaG와 ydbU genes의 PHA 생합성에서의 역할을 확인하기 위하여 paaG와 ydbU gene이 각각 knock-out된 mutant E. coli strains를 제작하였다. 제작된 mutant E. coli들은 모균주들보다 낮은 PHA 농도와 함량을 가졌으며, 이러한 결과들로부터 paaG와 ydbU는 fatty acid pathway에서 PHA synthesis의 전구체 물질들을 공급한다는 사실을 확인하였다. 또한, 새로운 FadB homologous enzyme YgfG를 탐색하였으며, ygfG gene이 overexpression된 균주와 ygfG mutant를 제작하여 PHA 합성을 실험한 결과 ygfG도 paaG나 ydbU와 유사한 역할을 한다는 사실을 밝혔다. 이러한 연구결과들은 E. coli에서의 MCL-PHA 단량체들의 합성 경로를 확인하여 효과적인 PHA 생산 균주를 제작할 수 있게 할 것이다.

In vivo characterization of FadB homologous enzymes including PaaG, YdbU and YgfG for medium-chain-length (MCL) polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis was carried out in fadB mutant Escherichia coli. Previously, it was reported that amplification of FadB homologous enzymes such as PaaG and YdbU in fadB mutant E. coli resulted in enhanced biosynthesis of MCL-PHA by greater than two fold compared with control strain. In this study, we constructed paaG fadB double mutant E. coli WB114 and ydbU fadB double mutant E. coli WB115 to investigate the roles of PaaG and YdbU in biosynthesis of MCL-PHA. Inactivation of paaG and ydbU genes in fadB mutant E. coli harboring Pseudomonas sp. 61-3 phaC2 gene reduced the MCL-PHA production to 0.16 and 0.16 PHA g/L, respectively from 2 g/L of sodium decanoate, which are much lower than 0.43 PHA g/L obtained with fadB mutant E. coli WB101 harboring the phaC2 gene. Also, we identified new FadB homologous enzyme YgfG, and examined its roles by overexpression of ygfG and construction of ygfG fadB double mutant E. coli WB113.