Earticle

본 연구에서는 높은 수율로 xylitol을 생산하기 위하여 P. stipitis CBS 5776으로부터 xylitol dehydrogenase (XDH)의 활성이 결여된 변이균주의 개발과 xylitol 발효 특성에 관한 실험을 수행하였다. EMS를 처리하여 XDH defective 변이균주인 PXM-4를 최종적으로 선별하였고, 변이균주 PXM-4의 XDH 활성을 측정하여 XDH 활성이 완전히 제거된 변이균주임을 확인하였다. 변이균주 PXM-4의 xylitol 발효에서 가장 적합한 cosubstrate로서 galactose를 선정하였다. Galactose와 xylose의 혼합당 배지에서 xylitol 발효를 수행한 결과 galactose의 농도가 20 g/L 이상에서는 xylitol 생산이 오히려 낮아졌고, 20 g/L의 xylose를 이용한 xylitol 발효에서 가장 적합한 galactose의 농도는 20 g/L 이었으며, 생산된 xylitol의 농도는 14.4 g/L 이었고, 수율은 97% 이었다. 또한 잔존하는 xylose를 완전히 xylitol로 전환시키기 위하여 xylitol 농도가 증가되지 않는 시기에 galactose를 첨가함으로써 최종 xylitol 농도를 25 g/L 까지 향상시켰다. 옥수수 속의 산 가수분해용액을 이용한 xylitol 발효에서 배지 내 존재하는 xylose는 모두 xylitol로 전환됨을 확인하였다. 이와 같은 결과에 따라 XDH defective 변이균주를 개발함으로써 높은 수율의 xylitol 생산이 가능함을 확인하였다.

In order to produce xylitol with high yield, experiments were carried out to develope xylitol dehydrogenase (XDH) defective mutant from Pichia stipitis and to investigate the xylitol fermentation characteristics of mutant strain. After treatment of P. stipitis with EMS, mutant PXM-4 was selected based on the XDH activity and xylitol production capability. Among the tested cosubstrates, galactose was selected as an adequate cosubstrate on xylitol production of mutant PXM-4. With the increase of galactose concentration, xylitol production was decreased because the transport of xylose into cell was inhibited by galactose. The optimal concentration of galactose for the production of xylitol using 20 g/L xylose was 20 g/L. Under this condition, maximum concentration of xylitol and yield were 14.4 g/L and 97%, respectively. In order to prevent the inhibitory effect of xylose transport by galactose, galactose was fed with low concentration and the concentration of xylitol produced was increased up to 25 g/L. In the fermentation of corn cob hydrolyzate by mutant PXM-4, xylose was completely converted to xylitol with a 100% yield in 4 days culture.

한국산 재배인삼과 장뇌산삼 그리고 중국산 장뇌산삼에 포함되어 있는 총 페놀성 성분 함량에는 큰 차이가 없었다. 그러나 개별적인 페놀성 성분들의 함량에서는 몇 가지 특징적인 경향을 나타내었다. Cinnamic acid와 p-hydroxybenzoic acid는 재배인삼보다 장뇌산삼에서 각각 3～4배, 2～3배 더 높은 함량을 나타내었다. Esculetin은 한국산 재배인삼과 장뇌산삼에서 중국산 장뇌산삼보다 더 높은 함량 수준을 나타내었는데, KM-1의 경우 47.2㎍/g으로 가장 높았다. Ferulic acid와 caffeic acid의 경우 KM-2에서 가장 높은 수준을 나타내었는데, 인삼의 적변현상에 관련된 성분으로 사료된다. Ester 상태의 총 페놀성 성분 함량은 장뇌산삼에서 재배인삼보다 3～4배 더 높았다. Panax ginseng에 포함되어 있는 페놀성 성분들은 완전한 성장연령이 지난 후에는 총 함량에 있어서 큰 차이를 나타내지 않았지만, 개별적인 페놀성 성분 함량과 존재 형태에 있어서는 서식지별 또는 재배방법 등에 따라 구분되는 함량차이를 나타내었다.

Differences in phenolic compounds were observed between cultured and mountain ginsengs. Cinnamic acid and p-hydroxybenzoic acid in Korean mountain ginseng and Chinese mountain ginseng were much higher than those in Korean ginseng. Contents of the esculetin in Korean cultured ginseng and Korean mountain ginseng were higher than that in Chinese mountain ginseng. The highest contents of esculetin in Korean mountain ginseng was 47.2 μg/g. Contents of the ferulic acid and caffeic acid in red colored Korean mountain ginseng were higher than any other ginseng.

Astaxanthin의 산업적인 생합성을 위하여 wild type인 P. rhodozyma B30 효모를 UV, NTG 등으로 돌연변이 처리하여 0.5 mM β-ionone이 포함된 선별배지에서 carotenoids 합성능력이 우수한 변이주 B76을 분리하였다. 변이주 B76은 wild type과 비교시 균체 생성능력은 큰 차이가 없었으나 carotenoids 합성능력은 40% 이상, astaxanthin 합성능력은 50% 이상 향상되었다. 선별된 변이주 B76의 최적 발효배지 및 배양조건 선정을 위한 플라스크 배양실험 결과 최적 탄소원으로 glucose가, 최적 질소원은 CSL : (NH4)2SO4 : yeast extract = 6 : 2 : 0.1이 혼합된 배지가 선정되었다. C/N ratio는 1.7～2.0 범위에서 유사한 발효성능을 보였으며(산업적인 생산성을 고려하여 2.0을 최적으로 선정), 배양온도는 22℃가 최적이었다. 초기 pH는 가장 높은 세포농도를 나타낸 6.0을 최적으로 하였다. 종균 접종량은 전반적으로 균체량과 carotenoids 합성능력에는 영향을 미치지 않았으며 산업적인 생산성을 고려하여 3%(v/v) 수준이 적절한 것으로 사료되었다. 이와 같이 플라스크 배양을 통해 확립된 최적 배지 및 배양조건을 기초로 5 L 발효조를 이용한 회분식 배양실험을 통해 탄소원의 최적 농도는 18%임을 확인하였다. 특히 B76 변이주는 22%(w/v)까지의 고농도 glucose 존재하에서도 catabolite repression을 받지 않는 것으로 나타났다. 용존산소가 부족한 경우에는 균체성장 및 색소합성이 저해되었고, 따라서 통기속도 1.0 v/v/m, 교반속도 400 rpm 이상을 유지함이 필요하였다. B76 세포는 배양 3일차에 exponential phase에 진입한 후(최대 Yx/s = 0.37) 배양 4일차에 stationary phase에 도달하였다. Carotenoids 및 astaxanthin 생합성은 세포성장이 정지한 후인 배양 5일차에 급격하게 증가하는(최대 Yp/s = 1.08) 전형적인 mixed-growth-associated 형태를 나타냈다. 이는 exponential phase 동안 급격한 균체성장으로 용존산소가 부족하여 NADH balance에 의해 astaxanthin 생합성 경로 중 탈수소화 단계가 저해되기 때문으로 사료되었다. 최종 세포농도는 43.3 g/L, 단위질량의 세포당 carotenoids 함량은 3.45 mg/g-DCW, 단위부피당 carotenoids 함량은 149.4 mg/L, astaxanthin 함량은 110.6 mg/L로서 산업적인 생산성이 있는 것으로 나타났다. 이번 연구를 통하여 개발된 변이주 B76 및 이의 대량발효를 위한 최적조건의 정립은 향후 astaxanthin의 산업적 생산공정에 중요한 기초자료로 이용될 것으로 기대된다.

Specific carotenoids and astaxanthin biosynthesis power of Phaffia rhodozyma mutant B76, which was obtained after NTG and UV treatments, was higher than those of the wild type by 40% and 50%, respectively. The mutant strain did not show the catabolite repression even at 22%(w/v) glucose concentration. The optimum C/N ratio was 2.0, and the optimum temperature and initial pH were 22℃ and 6.0, respectively. Both cell growth and astaxanthin formation decreased drastically as the fermentation temperature was increased over 22℃, whereas they were comparable in the pH range between 5.0 and 7.0. Inoculum size did not affect the final cell density nor the carotenoids biosynthesis, and 3%(v/v) was selected as optimal. Higher dissolved oxygen concentration facilitated astaxanthin biosynthesis, and aeration rate of 1.0 v/v/m and agitation speed of 400 rpm were selected as optimum. The final cell density of 43.3 g/L and the volumetric astaxanthin and carotenoids concentrations of 110.6 mg/L and 149.4 mg/L, respectively, were obtained. The specific carotenoids concentration was 3.45 mg/g-yeast(dry). Yx/s and Yp/s values of 0.37 and 1.08 were obtained. The result of this study will provide basic information useful for mass production of astaxanthin from P. rhodozyma fermentation.

알콜증류폐액에 빵효모를 배양하는 중에 glucose와 ammonium을 자동첨가함으로써 폐액배양액의 균체농도를 높여서 알콜증류폐액의 이용성를 증가시키고자 하였다. 배양중에 glucose를 공급하여 줌으로서 공급하지 않은 경우보다 1.3배 더 높은 균체농도를 얻었으며, glucose와 (NH4)2SO4를 공급하여 줌으로써 5.8배 더 높은 균체농도를 얻었다. Glucose의 경우에는 배양액의 DO를 제어파라미터로 하는 제어방법을 사용하여 자동첨가하고, ammonium의 경우에는 pH조정제로서 NH4OH을 사용함으로서 pH제어기에 의하여 자동으로 공급되도록 배양하였다. 배양결과 증식의 정체없이 배양 22.5시간후에 최대 12.0 g/L의 건조균체량에 도달하였으며, 균의 최대비증식속도는 0.18 hr-1였고, 대당균체수율이 약 0.54g/g이었으므로 glucose의 첨가가 경제적이라고 생각되었다. 증균배양으로 폐액배양액의 COD를 약 22% 더 감소시킬 수 있었다.

Addition of carbon and nitrogen source to an alcohol distillery wastewater was tried to increase the cell concentration of a baker's yeast cultivated in that wastewater. Carbon was found to be primary limiting nutrient and nitrogen secondary limiting one. Glucose addition increased the cell concentration 1.3 times higher than no addition, and both glucose and (NH4)2SO4 addition did 5.8 times. A fed-batch cultivation by the automatic addition of glucose and ammonium was executed. Added glucose was automatically controlled to low concentration by a method using DO as control parameter. Ammonium was automatically added as NH4OH used as pH control agent after initiating glucose addition. By this simple cultivation method the cell concentration could be efficiently increased from 2.6g/L to 12.0g/L, and maximum specific growth rate and biomass yield to glucose were 0.18hr-1 and about 0.54g/g respectively. By increasing cell concentration, COD of the wastewater media could be additionally reduced by about 22%.

알콜증류폐액에 빵효모를 배양하는 중에 glucose와 ammonium을 자동첨가하여 균체량을 효율적으로 증가시킴으로써 폐액의 재이용성을 향상시키고자 하였다. Glucose는 DO를 제어파라미터로 하는 제어방법을 사용하여 116 mg/L이하로 자동제어하였다. Ammonium의 경우에는 FIA를 이용한 온라인 자동계측제어장치와 프로그램을 이용하여 배양액의 ammonium농도를 자동분석하고 제어하였으며, ammonium농도를 7.0～27.7 mM의 낮은 농도범위로 유지시킬 수 있었다. Ammoniun농도를 제어한 본 실험의 최대비증식속도는 0.21 hr-1이었고, 대당균체수율은 약 0.78 g/g으로서 ammonium농도를 제 어하지 않은 경우에 비하여 대당균체수율은 약1.4배, 최대비증식속도는 1.2배 더 높아졌으므로 ammonium제어에 의하여 균의 glucose이용효율이 더욱 향상되었다. 대암모늄균체수율은 약 11.3 g/g이었다. Glucose와 ammonium을 첨가함으로써 균체량을 18.5 g/L까지 높일 수 있었으며, 이는 첨가하지 않은 경우보다 7.1배 더 높은 균체량에 해당한다. Glucose와 ammonium의 농도를 낮게 유지시킬 수 있었으므로 두가지 영양성분의 경제적인 공급이 가능하였다.

Automatic addition of glucose and ammonium to an alcohol distillery wastewater and the control of them at low concentration were tried to efficiently increase the cell concentration of a baker's yeast cultivated in that wastewater. Added glucose was indirectly controlled to less than 116 mg/L by a method which used DO as control parameter. Ammonium was automatically measured and controlled within the range of 7.0～27.7 mM by a homemade on-line system which adopted FIA as measurement method. Maximum specific growth rate and biomass yield to glucose were 0.21 hr-1 and about 0.78 g/g, which were significantly increased values in contrast to those of an experiment without ammonium control. Biomass yield to ammonium was 11.3 g/g. Cell concentration could be increased from 2.6 g/L to 18.5 g/L by the addion of glucose and ammonium.

Thiobacillus thiooxidans KCTC2505에서 메칠머캅탄(MM) 가스를 기질로 메칠머캅탄 산화효소(MMO)를 유도할 수 있었으며 DEAE-Sephacel과 Superose 12 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 이때 얻어진 각 효소의 비활성은 각각 19.7과 80.1 units/mg-protein이었으며 효소의 최적 온도는 43 oC였다. 상기 정제된 효소액은 SDS-PAGE상에서 68.1 kDa의 분자량을 가진다. 이 효소는 암모늄염의 존재하에서는 활성이 증가하였으나 KCl 존재하에서는 감소하였으며 NaCl에 대해서는 거의 영향을 받지 않는 특성을 가지고 있다. 에탄올, 메탄올, 글리세린의 첨가에 대해 효소활성은 부분적으로 불활성화되었으며 아세톤의 경우에는 완전히 저해되었다. Purpald 발색법을 이용한 흡광도의 변화는 구강내 존재하는 MM 가스로부터 생성될 수 있는 수 십 nmol의 범위의 포름알데하이드에 대해 눈으로 인지가능한 발색시스템에 사용할 수 있음을 확인하였다.

Methyl mercaptan oxidase was isolated and purified from Thiobacillus thiooxidans KCTC2505 for the detection of mercaptans. The procedure of purification involved DEAE-Sephacel and Superose 12 column chromatographies with recovery yields of 40 and 6.3%, and specific activity of 19.7 and 80.1 units/mg-protein, respectively. The molecular weight of purified methyl mercaptan oxidase was determined to be 68.1 kDa by SDS-PAGE. The extract from DEAE-Sephacel column chromatography had a high activity in oxidizing methyl mercaptan to produce formaldehyde which can be easily detected by purpald-coloring method. Optimum temperature for activity was observed at 43℃. This enzyme was activated by NH4Cl and (NH4)2SO4, and inhibited by KCl and NaCl.

본 연구는 Streptomyces sp. BH-405의 배양액으로부터 유기용매로 추출하여 지질과 산화에 대한 항산화 효과를 실험하였다. Streptomyces sp. BH-405의 배양액을 ethylether로 추출한 후 silica gel column(100×10 ㎝) chromatography로 분획한 획분을 POV로 측정한 결과 fraction 3에서 항산화 활성 이 가장 높았다. 항산화 활성이 높은 fraction 3 획분을 다시 preparative TLC와 column chromatography로 더욱 정제하여 band 2를 얻었다. Band 2의 항산화 효과를 알아보기 위해 기존의 항산화제와 비교한 결과 dl-α-tocopherol, BHA보다 산화억제 효과가 높았으며 DPPH에 의한 수소 공여능은 실험결과가 우수하였다. 한편 band 2는 쥐 간의 microsome에 있어서 유리기의 소거기능이 있었고 NADPH 및 Fenton 시액에 의한 효소적 과산화 지질의 생성을 억제하였다. 그리고 mitochondria와 리놀산의 과산화 유도계에서도 지질의 과산화 과정에 생성하는 유리기의 형성을 차단하였다. 결론적으로 Streptomyces sp. BH-405의 배양액에서 얻은 획분인 band 2는 산화를 억제하는 활성이 있었다.

Antioxidative activity of culture of Streptomyces sp. BH-405 was investigated. After removal of pellets of Streptomyces sp. BH-405, antioxidative substances were isolated and succesively purified from culture of Streptomyces sp. BH-405 by by thin layer chromatography (TLC) or silica gel column chromatography. The fraction 3 obtained from ethylether fractionation of the culture appeared highest level of antioxidative activity as determined by thiocyanate method. Band 2 obtained by further purification of this fraction showed higher antioxidation level than that of same concentration of dl-α-tocopherol, butylated hydroxy anisole (BHA). The band 2 showed higher rate of 1,1.diphenyl 2-picrylhydrazyl (DPPH) decolorization than dl-α -tocopherol. In the rat liver microsomes, band 2 rapidly inhibited lipid peroxidation which was initiated enzymatically by reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) or non-enzymatically by Fenton's reagent. Band 2 inhibited on lipid peroxidation of mitochondria or the linoleic acid hydroperoxide induced peroxidation system. It is concluded that band 2 obtained by fractionation of Streptomyces sp. BH-405 cultivation contained antioxidants with the capacity to inhibit oxidative modification.

해양에서 분리한 Streptomyces sp. BH-405의 배양액으로부터 정제하여 얻은 항산화 활성이 우수한 획분 band 2 에 대하여 사람 Low Density Lipoprotein(LDL)의 산화 억제 효과에 대하여 실험하였다. Streptomyces sp. BH-405의 배양액으로부터 분리 정제한 획분 band 2는 LDL에 대한 5 μM CuSO4의 유도 산화를 측정한 결과 100 및 200 ㎍/mL에서 LDL의 산화억제 효과가 높았다. 그리고, band 2를 이용한 macrophage 및 J774 유도 LDL의 수식에 대한 항산화 효과도 native LDL에 비하여 높았다. 이때 같은 농도의 band 2를 첨가하여 산화 LDL의 전기영동의 이동거리를 측정한 결과 native LDL보다는 약간 높았으나 Oxid LDL의 대조군보다는 이동거리가 낮으며 공액2중결합의 생성억제 효과도 있었다. 사람 LDL의 산화에 대하여 macrophage 및 내피세포를 이용하여 125I-LDL 산화에 대하여 band 2를 각각 100 및 200 ㎍/mL씩 첨가하여 실험한 결과 사람 LDL의 분해는 대조구보다 낮았으며 용량 의존형의 결과를 나타내었다.

This study was designed to investigate the antioxidative activity on oxidation of human low density lipoprotein(LDL) of band 2 fractionated from culture broth of Streptomyces sp. BH-405. Antioxidative activity of band 2 obtained from fractionation of BH-405 culture purification was measured against Cu2+ mediated human LDL oxidation by thiobarbituric acid reactive substance. CuSO4 mediated oxidation of LDL was degraded at a much higher rate than native LDL. Band 2 at a concentration of 100 or 200 μg/mL inhibited the oxidation of LDL induced by CuSO4, The formation of conjugated dienes induced in the presence of 5 μM CuSO4 of the mouse macrophage and J744. The electrophoretic mobility of the LDL in addition of 200 μg band 2 in the presence of 5μM CuSO4 was lower than that of native LDL. LDL modified by copper mediated or cell mediated uptake was degraded by macrophage at much greater than native LDL, and band 2 was found as potential inhibitor of modification of 125I-labelled LDL by macrophage.

도라지에 H2O, ethanol, ethyl ether와 petroleum ether를 용매로 하여 추출한 시료를 기관지질환 유발세균(S. aureus, C. diphtheriae, Mycobacterium sp., F. nucleatum, A. fumicatus, K. pneumoniae, S. pyogenes N. gonorrhoeae)에 투여한 결과 ethyl ether, petroleum ether, H2O와 ethanol의 순으로 항균력이 우수하다는 것이 판명되었다. 특히, ethyl ether에 의한 도라지 추출물의 항균력이 80%이상 뛰어난 효과를 나타내었다. 우수한 항균력을 가지는 도라지 추출물의 농도는 30mg부터 30%이상의 억제작용을 보였으며 70mg에서 70%이상의 세포성장이 저해되는 현상을 관찰하였다. 기관지 질환 유발세균에 대한 도라지의 효과는 대조구에 비해 70%이상의 탁월한 항균효과가 있는 것으로 확인되었다.

This study was performed to observe the effects of Platycodon grandiflorum A. DC (3 years) extracts on the bronchus diseases bacteria(Mycobacterium sp., K. pneumoniae, F. nucleatum, S. aureus, C. diphtheriae, S. pygogenes and N. gonorrhoeae) and fungi(A. fumigatus). Platycodon grandiflorum A. DC was extracted by ethanol, water, ethyl ether and petroleum ether. The extraction rates of Platycodon grandiflorum A. DC were identified as 71.8%, 100%, 15.4% and 14.1% in each extract solution. Each extract solution was injected into culture media with several concentrations and then the bacteria cell growth was investigated during 32 hours. As a result, the antimicrobial activities of extracts from ethyl ether and petroleum ether were excellent. Among several concentrations, the percentage of bacteria cell growth inhibitions were observed to be from 0.06% to 0.14%. The rates of antimicrobial activities were over 70%. The degree of cell growth inhibition of each bacteria was appeared in the order of ethyl ether > petroleum ether > water > ethanol.

굴 자숙액 중에 함유되어 있는 정미성분, 당 및 단백질 등의 유용성분을 이용하고자 자숙액 중에 함유되어 있는 다량의 염을 제거하기 위하여 전기투석에 의한 최적의 탈염조건을 구명하였다. 자숙액 중의 건조중량에 대한 당과 단백질의 함량은 각각 71.25%와 25.05%였으며, 염의 농도와 pH는 각각 10.81%와 5.62였으며, 핵산관련물질 중 정미성분인 IMP의 함량은 2.15μmole/g이었다. 전기투석에 의한 자숙액의 탈염에 필요한 이온교환막은 분자량 100 Da이상을 회수할 수 있는 AC-110-400과 300 Da 이상을 회수할 수 있는 AC-220-400을 상호 비교한 결과, 탈염율과 탈염시간의 차이는 거의 없었으 며, 당과 단백질의 유실량이 적은 AC-110-400을 사용하는 것이 보다 효율적인 것으로 나타났다. 자숙액의 탈염에 영향을 주는 인자들 중에서 자숙액의 농도는 1% (w/v) 용액에서 탈염시간은 60분이었으며, 농도가 증가함에 따라 탈염시간은 길어졌다. 자숙액의 염농도는 탈염초기에 급격하게 감소하였고, 8% (w/v) 용액에서 240분에서 96%까지 탈염되었다. pH에 따른 자숙액의 탈염은 탈염초기에 거의 비슷한 경향으로 탈염이 진행되었지만, 최종 탈염율에서는 pH 9.0의 알칼리 영역보다 pH 4.0의 산성영역에서 탈염율이 높았다. 또한, 자숙액의 부피에 대한 탈염율은 부피가 증가할수록 탈염에 소요되는 시간은 길어졌으며, 투과액의 부피와 종류는 자숙액의 최종 탈염시간 및 탈염율에 거의 영향을 주지 않았다. 자 숙액의 탈염은 주로 자숙액의 농도와 pH에 의해 크게 영향을 받았으며, 5%의 자숙액 1ℓ, pH 5.62에서 전기투석기를 사용하여 효율적인 탈염이 가능하였다.

For selective elimination of salt from boiled oyster extract (BOE), electrodialyzer was used and the desalination conditions of BOE were investigated. The ion-exchange membrane with a molecular weight cut off 100 Da was used for desalting of BOE. The desalination efficiency at pH 4.0 was 13% higher than that at pH 9.0 when BOE was desalted for 90min. The electrodialysis process could remove above 90% of the initial salt content when 5% BOE was desalted at pH 5.62 for 100min. The initial volume and concentration of permeation solution did not have significant effects on desalination time and ratio. The important factors for the desalination of BOE were found to be pH and concentration of BOE. The results obtained prove that electrodialysis is a practical solution to the problem of selective elimination of salt from BOE.

본 연구에서는 다른 host cell에 비하여 여러 가지 장점을 가지고 있는 Methylotrophic yeast중 Pichia pastoris와 Hansenula polymorpha의 fed batch 실험을 통하여 유전자 재조합 단백질 발현최적조건을 구하여 각 균주의 유전자 재조합 albumin 발현 최적화 연구를 수행하였다. 글리세롤이 두 균주의 promoter인 AOX 1과 MOX promoter repression에 미치는 영향을 확인한 바 H. polymorpha가 P. pastoris보다 promoter repression이 심함을 알 수 있었다. 두 균주의 promoter를 induction시키는 최적 메탄올 농도는 P. pastoris의 경우 메탄올 8g/L, H. polymorpha의 경우는 13 g/L임을 알 수 있었다. 또한 메탄올에 의한 induction시기는 두 균주 모두 O. D. 4정도되는 exponential growth stage에서 메탄올을 첨가하는 경우가 초기 세포 성장단계에 메탄올을 첨가한 경우에 비해 약 20% 정도 높아짐을 확인하였다. 두 균주의 재조합 albumin 발현에 미치는 pH의 영향을 조사하였는데, P. pastoris의 경우 pH 5에서 가장 높은 albumin 생산성을 보여 약 300mg/L albumin을 발현하였고 H. polymorpha 의 경우 pH 5와 6에서 최대 약 180 mg/L의 albumin을 발현하였지만 pH 8에서는 이의 절반 수준에 그쳤다. 두 균주의 최적 fed-batch방법을 확인하는 실험을 수행하였는데 P. pastoris의 경우의 최적 fed-batch 방법은 mixed feeding은 바람직하지 않고 글리세롤 배지를 공급하여 세포를 성장시킨 후 글리세롤 공급을 멈추고 바로 메탄올로 전환하는 방법을 효과적이며 H. polymorpha의 경우 비성장속도 제어를 통한 글리세롤 공급으로부터 메탄올 공급으로의 단계적 전환방법이 균주의 albumin 발현에 큰 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 이 방법을 통하여 두 균주의 고농도 배양 실험을 수행한 결과 P. pastoris의 경우는 O.D. 150에서 약 9.5g/L, H. polymorpha의 경우는 O.D. 300에서 약 4.7g albumin/L를 발현하였다. 이와 같은 결과를 바탕으로 산업체에서 methlotrophic yeast를 이용한 상업화를 계획함에 있어서 host로서의 균주를 선택할 수 있는 기본 자료를 제공함과 아울러 균주가 선택된 후에 그 균주를 이용한 재조합 단백질 최적화 방법을 제공하여 줄 것으로 생각된다.

Pichia pastoris and Hansenula polymorpha, the methylotrophic yeasts have been widely used as a host for the production of eudaryotic proteins due to the advantages related to their inherited characters. This paper describes the method to enhance the productivity of recombinant proteins by P. pastoris and H. polymorpha. In the production of recombinant proteins using a fed batch fermentation system, the effects of specific growth rate on the specific expression rate of recombinant proteins were studied. In both species, the expression system of recombinant proteins using the fed batch fermentation was optimezed.

본 연구에서 갈락토즈를 거의 이용하지 않고 glucose repression 정도가 줄어든 변이주를 이용하여 fed-batch를 통한 발현최적화를 수행하였다. 두 균주에서의 GAL promoter에 의한 외래단백질 생산시 glucose repression 정도에 대해 조사하였는데 대조구 Y2805는 글루코즈가 다 소비된 후 2～ 3시간 지난 후 발현이 시작되나 변이주 Y334는 약 0.5 g/L 글루코즈 농도에서 25%정도의 발현이 이루어짐에 따라 변이 주 Y334는 GAL promoter에 미치는 glucose repression정도가 매우 약한 장점을 확인하였다. 배양 중 재조합 미생물인 두 균주 변이주 Y334와 대조구 효모 Y2805의 plasmid stability 에 대해 조사하였다. mutant Y334의 경우 generation number가 13에 이를때까지 plasmid stability는 거의 95%로 유지되어 매우 안정한 균주임을 알 수 있었으며 대조구 Y2805의 경우도 plasmid stability는 90%로 유지됨을 알 수 있었다. GAL promoter에 의한 외래 단백질 생산시 발현을 위한 최적갈락토즈 농도를 조사하였는데, Y2805는 3% 까지의 높은 갈락토즈 농도에서 최대 발현량을 보였으며 변이주 Y334는 높은 갈락토즈 농도에서 growth inhibition을 보였다. 두 균주를 이용하여 배지중 pH가 외래 단백질 생산에 미치는 영향을 조사하였는데 두 균주 모두 pH 5근처에서 최대 발현량을 보임을 알 수 있었다. GAL promoter에 의한 외래 단백질 생산시 글루코즈와 갈락토즈, 에탄올의 소비속도를 조사하였는데, 글루코즈와 에탄올의 소비속도는 거의 비슷하였으나 갈락토즈 소비속도는 Y2805는 0.1232 g/L/hr/O.D.이고, 변이주 Y334는 0.0131 g/L/hr/O.D. 이다. 또한 mutant Y334 와 대조구 효모 Y2805의 Fed-batch시의 올바른 feeding 방법을 구하기 위한 실험을 수행하여 각 균주의 Fed-batch실험에서의 최적 발현 방법을 획득하였다.

The production of heterologous protein using GAL promoter in conventional S. cerevisiae has several problems to solve for commercialization. In this research, S. cerevisiae mutant(reg1-501, gal1), which cannot use galactose and has alleviated glucose repression level, is used as host for optimizing induction of GAL promoter. In this experiment, the effects of specific growth rate on specific recombinant protein expression rate were tested in both cases and optimum fed batch fermentation method was obtained in both cases. Through these experiments, optimum condition of recombinant protein production by GAL promoter using S. cerevisiae mutant (reg1-501, gal1) were found.

본 연구에서는 P. productus를 이용하여 체계적인 CO로부터 아세테이트 전환방법 최적화 연구를 수행하였다. 먼저 CO소비속도에 대한 kinetic model과 그에 따른 여러 가지 상수 값을 계산하여 Vmax와 Km은 각각 39.3 mmol/L-hr-O.D., 0.578 atm임을 알 수 있었으며 또한 고농도 구간에서 CO의 저해상 수 KSI는 0.792 atm이었고 Smax는 0.677 atm 이었다. 질소원인 YP의 농도에 따른 아세테이트 생산 정도는 YP농도가 증가할수록 세포의 성장과 생성된 아세테이트의 양이 증가하여 YP 3%의 경우 O.D. 1.14에서 약 6g/L 의 아세테이트를 생성함을 알 수 있었다. 그러나 아세테이트 생성속도는 YP농도 2%와 3%에서 최대값이 0.11 g/L․hr․O.D로 비슷하였다. P. productus를 이용해 아세테이트 생성을 최적화 하기 위한 초기 pH실험의 결과 pH 6, 7 그리고 8의 경우는 O.D. 약0.7에서 3 g/L 아세테이트를 생성하여 거의 비슷한 양상을 보였다. 또한 P. productus의 아세테이트 생성 최적 온도는 37℃임을 확인하였다. 기상과 액상의 접촉 표면적의 한계에 의한 물질전달문제의 해결을 위하여 5L 발효기에서 고농도 아세테이트 생성실험을 수행하였다. 균주성장의 경우 O.D. 약 1.4까지 성장하였다. 아세테이트의 경우 접종초기 낮은 생성속도로 생성되다가 60시간 이후 활발한 생성을 보여 약 21g/L를 생산하였다. 이때의 최대 아세테이트 생성속도는 0.48 g acetate/L․hr․O.D. 이었고 최대 CO 소비속도는 26.4 mmole CO/L․hr․O.D.이었다. 이 수치는 bottle의 경우 0.11 g acetate/L․hr․O.D에 비하여 4배이상 증가한 값이고 생성량에 있어서도 약 4배가 증가하였다. P. productus가 이산화탄소와 수소로부터 아세테이트를 만드는 것으로 확인되는바 이산화탄소와 수소를 이용한 균주성장 정도와 아세테이트 생성량을 확인하는 실험을 수행하였다. 30% 와 20% CO2, 거기에 H2를 각각 10%, 20% 주입한 경우를 비교하였는데 각 경우 모두 비슷하게 O.D. 0.5 정도에서 약 2g/L의 아세테이트를 생성하였다. 이상의 연구를 통하여 CO를 이용한 CSTR 실험시 pH조절과 배양중 질소원등 배지의 추가 공급, 그리고 CO 머무름 시간, 교반속도의 물질전달에 영향을 주는 요인 들을 적절히 조절할 경우 생물학적 아세테이트 생성공정은 경제적으로 충분한 가치가 있을 것으로 기대되어진다.

The anaerobic bacterium P. productus was known to produce acetate from CO, CO2 and H2. In this research the acetate formation from waste gas was studied. For this research, kinetic parameter study on CO conversion were carried out. From this study maximum CO conversion rate of 39.3 mmol/L․hr․O.D and Km of 0.578 atm were obtained. Also the effect of CO refreshment, N source, initial pH and culture temperature on acetate formation were studied. Acetate formation in 5L labscale fermenter was tested and specific acetate production rate of 0.48 g/L-hr-O.D. was obtained and the acetate concentration was 21g/L.

네 종류의 질소원 yeast extract, sodium glutamate, peptone, tryptone과 각 질소원의 농도 및 포도당의 초기 농도가 해양미생물 Thraustochytrium aureum ATCC 34304의 linoleic acid 생산성에 미치는 영향을 규명하여 다음의 결과를 얻었다. 초기 당 농도를 10 g/L로 하고 질소원으로는 sodium glutamate를 사용하였을 때 균체 단위 질량에 대해 생성된 지질의 중량 분율이 최대값 0.302 mg/g를 나타내었으며, 균체에 대한 linoleic acid 중량 분율도 8 %로 최대값을 나타내었다. Linoleic acid의 생성속도는 질소원으로 peptone과 sodium glutamate를 사용하였을 경우 다른 질소원을 사용하였을 때 보다 2.5 배까지 높은 수치를 나타내었다. 초기 당 농도가 증가하면 linoleic acid의 생산성은 상승하나 당 농도 30 g/L 이상에서는 그 상승폭이 대단히 완만하였다. 초기 당 농도가 30g/L인 경우 질소원으로 peptone을 사용하였을 때는 linoleic acid의 생산량이 200 mg/L, sodium glutamate를 사용하였을 때는 130 mg/L를 나타내었다. 질소원의 농도가 증가하면 균체 내에 생성되는 지질의 양도 증가하는 경향을 나타내었다. 질소원이 sodium glutamate인 경우 농도 1 g/L까지는 지질의 함량이 뚜렷한 증가현상을 나타내었으나 농도 1.0 내지 2.0 g/L 사이에서는 지질 생성량이 완만하게 증가하였으며, 2.0 g/L 이상에서는 질소원의 농도가 증가하면 지질의 생성량이 감소하였다.

Studies were made on the optimization of media to cultivate Thraustochytrium aureum ATCC 34304 for the enhanced production of linoleic acid. The medium optimization was made with the artificial sea water medium. Yeast extract, sodium glutamate, peptone and tryptone were considered as nitrogen source. The effect of concentration of nitrogen source as well as initial glucose on the production of linoleic acid were investigated to optimize the media. The maximum yield of lipid was 0.302 mg/g cell mass when initial glucose concentration was 10 g/L and sodium glutamate was used as nitrogen source, and the yield of linoleic acid to unit cell mass was also maximum to be 8 % in that case. The highest linoleic acid concentration was obtained in the initial glucose concentration 30 g/L regardless of the kinds of nitrogen source and the linoleic acid concentration was 0.208 g/L when peptone was supplemented to be 2 g/L.

전통적으로 사용되어 왔던 점토의 숙성과정을 과학적으로 규명하였고, 철환원세균의 농화배양액을 이용하는 생명공학기술을 이용한 개량된 점토 숙성방법을 연구하였다. 전통적으로 사용되어 왔던 수비법에 의한 점토의 숙성은 토착 미생물들이 점토에 함유된 유기물을 분해하는 과정에서 철불순물을 점토로부터 제거하여 색상을 향상시킬 뿐만 아니라 점토의 점성과 가소성 및 강도를 증진시키는 효과가 있음을 알 수 있었다. 점토숙성용 철환원세균 농화배양액을 얻는 방법을 제시하였고, 점토에 탄소원을 첨가한 후 혐기적 조건에서 농화배양액을 이용한 점토 숙성 방법을 제시하였다. 생물공학 기술을 활용한 개량점토 숙성법은 전통적인 점토 숙성에서 소요되는 점토의 처리 시간을 약 1/6 수준이하로 단축시킬 수 있었고, 점토로부터 철불순물을 보다 효과적으로 제거할 수 있었을 뿐만 아니라 전통적인 방법보다도 물성이 우수한 점토로 고품위화가 가능하였다.

The traditional ripening method of clay was analyzed. An advanced refining method of clay using enrichment cultures of iron reducing bacteria was developed. After the traditional ripening, the whiteness of the clay was increased due to removal of iron impurities by inhabitant dissilmaltien with iron reducing bacteria. Other characteristics of the refined clay such as viscosity, plasticity, and strength were also improved by iron reducing bacteria. An advanced method of clay refinement with anaerobic enrichment cultivation of iron reducing bacteria supplemented with an extra carbon source such as glucose was suggested. When the clay was treated by the advanced method, the refinement time could be reduced to 1/6 of that required by the traditional method. The physical properties of the refined clay by the advanced method were better than those of the traditionally refined clay.

백자, 청자 및 일반 자기 제조용 점토인 3종류의 점토(백토, 청토, 황토)를 철환원 미생물을 이용한 숙성과정을 통해 점토의 개질을 수행하였다. 철환원 미생물을 이용한 숙성기간 동안 점토 종류에 따른 철환원 및 용출특성과 숙성된 점토들의 물성 변화를 조사하였다. 숙성기간동안 점토의 철용 출량은 점토의 종류에 관계없이 탄소원인 sucrose의 첨가량이 증가할수록 증가하였지만, 총 철용출량과 용출속도는 점토의 종류에 의존하였다. 숙성점토는 원료물질과 비교하여 sucrose의 첨가량이 증가함에 따라 수축율 변화없이 강도와 색도가 향상되었다. 점토의 색도는 점토의 종류에 많은 영향을 받았으며, 점토의 숙성과정은 색도 중 적색도가 가장 많이 감소하는 효과를 제공하였다. 숙성점토의 물리적 특성과 탈철양 을 고려할 때, 점토 중에 함유된 철환원을 전자공여체로 제공되는 sucrose의 최적 첨가량은 4wt% 임을 확인하였다.

Using three types of porcelain clays such as White, Blue, and Yellow clays, which were used as raw materials for Baekja, Chungja, and common porcelains, the biological refinement by an enrichment culture of iron reducing bacteria was studied. In the biological clay refining, amounts of leached iron increased as increasing sucrose concentration, which was supplemented as a carbon and electron donor source for cell growth and iron reduction. Total amounts of the leached iron and specific rate of iron reduction were dependent on the types of the clay. Strength and chromaticity of refined clays which are important properties required for porcelain clays were improved as increasing sucrose concentration. The degree of shrinking, however, did not changed. the redness among the chromaticity of refined clays is favorably reduced through the ripening by the iron reducing bacteria. Considering iron removal efficiency and the change of physical properties, the optimal concentration of sucrose was 4%(w/w) in the clay.

면역크로마토그래피 진단방법을 이용하는 B형간염 스크리닝 kit를 개발하기 위하여 두가지의 항체를 이용하였다. 표식자항체로 사용된 것은 단세포군항체 anti-HBs이고 포획항체는 goat anti-HBs인데 포획항체는 니트로셀룰로즈 막에 고정되고 표식자항체는 금 입자에 결합된다. 혈청 검체를 well에 가하면 유리섬유 표면에 건조상태로 침착되어 있던 conjugate가 활성화되어 검체중의 HBsAg와 결합한다. 검체를 가한 지 5분 후 검사결과가 나타나는데 HBsAg와 conjugate가 결합된 복합체가 니트로셀룰로즈 막의 하단부에 붉은 색 선으로 나타난다. 본 kit의 검출한계는 표준 HBsAg 용액을 사용하여 시험하였을 때 2 ng/ml이었다.

A hepatitis B Surface Antigen(HBsAg)-screening kit using immunochromatographic assay(ICA) method was developed by employing two kinds of antibodies. One is mouse monoclonal anti-HBs for tracer antibody and the other is goat polyclonal anti-HBs for capture antibody. This capture antibody was immobilized on the surface of nitrocellulose(NC) membrane and the tracer antibody was conjugated with gold particles. When serum sample was added to the sample well, the conjugates deposited in a dry state on the surface of glass fiber filter were reconstituted and then combined with HBsAg in serum. In 5 min after adding, the assay result was visible through the window, that is, the complexes composed of HBsAg and the conjugates appeared as maroon line on the lower part of the NC membrane. The detection limit of the ICA kit was 2 ng/ml when being tested with the reference HBsAg.