Earticle

형광을 이용한 암 진단을 위해 배양된 정상 및 암세포주에 광민감제인 5-ALA를 투여하고 세포 내ㆍ외에서 생성된 Protoporphyrin IX (PpIX)의 형광을 측정하여 5-ALA 투여의 최적농도를 조사하였다. 정상 간세포주 (Chang) 및 자궁경부암 세포주 (HeLa)에 5-ALA를 농도별로 투여하여 ALA에 의해 유도된 PpIX의 생성을 확인하고, MTT assay로 세포생존율을 측정하였다. 배양된 cell에 5-ALA를 투여한 후 24시간 동안 배양함으로써 생성되는 PpIX의 양은 형광의 강도로 측정하였다. HeLa 세포주에 대한 5-ALA의 최적농도는 50 μg/mL이며, 이 때의 형광 (emission) 스펙트럼은 여기 파장이 410 nm일 때 602.3 nm, 659.9 nm에서 형광 봉우리가 관찰되었다. PpIX의 형광 강도를 측정한 결과, PpIX는 정상세포에서는 낮은 농도로 축적이 되는 반면에 암세포에서 더 높은 농도로 축적되었으며, 세포 외보다는 세포 내에서 더 높은 농도로 축적됨을 알 수 있었다.

To clarify the usefulness of fluorescent diagnosis for cancer, We investigated the optimal method of administrating 5-aminolevulinic acid (5-ALA) by analyzing fluorescence signal of Protoporphyrin IX (PpIX) in the cultured normal and cancer cells. 5-ALA was injected as a photosensitizer to the cervico-uterine cancer cell line (HeLa) and in normal liver cells (Chang). Chang and HeLa cells were incubated with various concentrations of 5-ALA (0-800 ㎍/㎖). The accumulation of PpIX induced by 5-ALA was in HeLa and Chang cells. The cell viability was measured by MTT assay. The optimal concentration of ALA that induced maximum levels of PpIX was 50 ㎍/㎖ in HeLa cell cultured for 24 hours after 5-ALA injection. Fluorescence of PpIX in HeLa cell was excited at a wavelength (λ=410 ㎚) and showed an emission spectrum at 602.3 ㎚, 659.9 ㎚ which could be related to the PpIX generation induced by the applied 5-ALA. The experimental results showed that fluorescence signal of PpIX was proportional to the concentration of 5-ALA in cancer cells, but measured with low concentration in normal cells.

전기장하 토양 내에서 미생물 이동은 주로 전기영동과 전기삼투에 의해 일어나며 미생물의 이동속도와 유속에 대한 전기영동의 공헌도가 전기삼투보다 대체로 높게 나타났다. Pentadecane-오염토양에 대해 동전기 생물학적복원을 실시한 결과 토양내 미생물 농도는 전기영동과 전기삼투가 함께 작용하여 양극과 음극의 인접 토양에서 동시에 증가하였으며 초반 공정이후에는 미생물의 표면전하특성과 양극의 산소발생에 의하여 미생물 농도가 양극, 중간, 음극의 순서로 나타났다. 하지만 미생물의 양방향 이동으로 토양의 모든 위치에서 오염물이 균일하게 제거될 수 있었다. 미생물의 전기적 이동을 이용한 동전기 생물학적복원은 기존의 생물학적복원의 단점인 늦은 분해속도와 낮은 제거효율의 단점을 극복할 수 있었다.

In this study, it could be found that the microbial movement in soil under electric field mainly occurred by electrophoresis and electroosmosis. The contribution of electrophoresis on the microbial mobility and flux was generally higher than that of electroosmosis. In the electrokinetic (EK) bioremediation of a pentadecane-contaminated soil, the microbial population increased simultaneously at anode and cathode regions of the soil specimen because both electrophoresis and electroosmosis affected on the microbial movement. After initial operation, the microbial population was high in order of anode, middle, and cathode regions due to their negatively-charged surface and oxygen generation at anode. However, the uniform contaminant removal was achieved by the microbial movement with two-directionality.

본 연구에서는 phenanthrene-오염토양의 정화를 위한 동전기 생물학적복원에서 나타나는 pH 조절과 관련한 문제점과 이것에 대한 해결방법이 복원효과에 어떠한 영향을 주는지 조사하므로써 앞으로의 방향을 모색하고자 하였다. 플라스크 배양실험에서 Sphingomonas sp. 3Y를 이용하여 phenanthrene를 분해하기 위해서는 황산염을 적절한 농도로 공급하는 것이 중요하였는데 동전기 생물학적복원에서는 MgSO4를 황산염원으로 공급했을 때 Mg이온이 음극에서 생성된 수산화이온과 결합하여 침전물을 형성하고 토양과 생물반응기의 pH를 과도하게 감소시키므로 미생물활성을 저해하고 제거효율이 감소되었다. 따라서 pH를 중성으로 유지하기 위해 강한 완충성분을 사용한 경우 비록 pH와 미생물활성은 잘 유지되었지만 제거효율이 크게 감소되었다. 한편 낮은 농도로 MgSO4를 공급했을 때 역시 pH와 미생물활성은 잘 유지하였으나 제거효율이 다소 감소하였다. NaOH와 같은 중화제를 첨가한 경우에는 토양 pH의 상승하여 제거효율이 감소되었다. 결과적으로 전해질 조성은 동전기 생물학적복원의 복원효율에 매우 중요한 요소이며 앞으로 오염물 분해와 미생물활성유지에 적합한 황산염원이 조사되어야 한다.

In this study, problems related with pH control in electrokinetic (EK) bioremediation of phenanthrene contaminated soil were observed, and the effects of pH control methods on the removal efficiency were investigated to search a further application strategy. In a preliminary experiment, it was found out by flask cultivation that a certain sulfate concentration was needed to degrade phenanthrene well using Sphingomonas sp. 3Y. However, when MgSO4 was used as sulfate source in EK bioremediation, the bacterial activity reduced seriously due to the abrupt decrease of pHs in soil and bioreactor by the combination of magnesium and hydroxyl ions. When another strong buffering compound was used to control the pH problem, the good maintenance of the bacterial activity and pHs could be observed, but the removal efficiency decreased largely. When a low concentration of MgSO4 was added, the removal efficiency decreased somewhat in spite of the good maintenance of neutral pHs. With the addition of NaOH as a neutralizing agent, the removal efficiency also decreased because of the increase of soil pH. Consequently the selection of electrolyte composition was a very important factor in EK bioremediation and some sulfate sources suitable for both bacterial activity and contaminant degradation should be investigated.

본 연구에서는 신 개념의 바이오필터 시스템인 RDBF를 이용하여 기상의 styrene을 제거하고자 하였다. 다양한 운전조건에서 시스템의 성능을 평가하고, 진공흡입을 통해 과다성장 미생물을 제어하고자 하였다. RDBF에서는 sheet 형태의 충진 담체를 사용하므로 영양원 및 공기의 균일한 공급이 가능하였고, 빠른 속도로 균일한 미생물 층을 담체 표면에 형성할 수 있었다. 또한 기-액 접촉면적을 증대 시켜 95% 이상의 안정적이고 높은 styrene 분해 효율과 125g/m3․h의 높은 제거 용량을 가질 수 있게 해주었다. 하지만 우수한 성능은 미생물의 과다성장에 따른 기공의 폐쇄현상 때문에 오래 지속되지 않았고 반응기의 성능과 안정성은 급속히 저하되었다. 이를 해결하기 위해 진공흡입을 통한 미생물 제거를 시도하였으나 제한적인 효과만을 확인하였다. 향후 RDBF 반응기의 상업화를 위해서는 보다 효율적인 미생물 제어 방법이 개발될 필요가 있다.

A new type of biofilter, a rotating drum biotrickling filter (RDBF), was developed and operated for the removal of styrene from industrial waste gas. The porous polyurethane foam sheet was used as a packing materials for the RDBF and a pure culture of Gram-positive bacterium Brevibacillus sp. SP1 was used as an inoculum. The reactor showed a short start-up period of 18 days, during which uniform biofilms were developed on the packing. During a steady operation at an incoming styrene concentration of 200 ppmv and a retention time of 0.5 min, a high and stable removal of styrene over 95% was observed. The maximum elimination capacity was estimated to be 125 g/m3․hr. The outstanding performance was attributed to an efficient gas-liquid mass transfer and the appropriate supply of nutrient solution to the biofilm microorganisms on the packing by the rotation of the drum.

본 연구는 초임계 이산화탄소와 에탄올 보조용매를 사용하여 천연물질에 존재하는 기능성 물질을 효율적으로 분리하여 식품 및 의약산업에 이용할 수 있는 천연 기능성 소재를 제공할 수 있는 가능성을 보여 주었다. 초임계 이산화탄소와 보조용매 에탄올 3 mL/min를 사용하여 멍게로부터 β-carotene을 추출하기 위한 최적의 조건은 35℃, 350 bar이었으며, 추출물질을 흡착하는 흡착칼럼으로부터 β-carotene을 회수하기 위한 rinse 용매는 methanol이 우수한 결과를 나타내었다. 따라서 초임계 이산화탄소를 사용한 멍게 껍질로부터 β-carotene 추출 공정이 상업화될 경우 기존의 재래식 유기용매 추출법에서 회수한 것에 비해 잔존 유기용매가 없고 환경 친화적 공정으로 식품, 의약품 산업 등의 고품질 원료 소재로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

Dried raw Ascidians (Halocynthia roretzi) shells harvested from fish farms in southern coast area in Korea were used to extract β-carotene using supercritical carbon dioxide (SCO2) and with ethanol as a co-solvent at the range of temperatures and pressures, from 25 to 65℃ and 100 to 350 bar respectively. The size of the dried Ascidians shells was around 850 μm. The system used this study was a semi-batch flow type high pressure unit. The efficiency of β-carotene extraction using SCO2 with and without co-solvent, ethanol, influenced to pressure and temperature changes. The highest solubility of β -carotene in SCO2 was 1.35 mg/g for β-carotene at 35℃ and 350 bar. With addition of 2 (v/v%) ethanol the recovery of β-carotene was 93%. As a result of using n-hexane and methanol for rinse, at 35℃ and 350 bar the amount of β-carotene by methanol rinse was 5 times higher than that of n-hexane rinse.

본 연구에서는 에탄올 농도에 따른 모델용액과 발효액에서 여러 유기산들의 침전거동을 조사하였다. 발효액에서 에탄올의 농도가 높을수록 Ca(LA)2의 침전양이 많았다. Ca(LA)2의 침전효과는 발효액 내에서도 비슷하게 관찰되었다. 모델용액이나 발효액과의 혼합물 대비 30% (v/v)로 에탄올을 첨가하였을 때 젖산분리 공정의 불순물로 존재하는 다른 organic salt들의 침전율도 높았다. 따라서 전체 젖산회수공정의 효율에 대한 연구에서는 에탄올과 발효액의 혼합비율을 20%로 하였다. 반응증류시 일정 온도 이상에서는 젖산회수율이 차이나지 않았다. 에탄올이 첨가된 발효액에서는 대조군과 비교하여 최종젖산 회수율이 38.9% 증가하였다. 또한, 다른 유기산들을 포함한 회수액 에서의 순도도 99.7%에 달하였다. 이러한 젖산 회수율의 증가는 drowning-out crystallization에 의한 Ca(LA)2의 용해도 감소에 기인한 것으로 판단한다. 본 실험 이후에 더 높은 젖산 회수와 정제 효율을 얻기 위해서는 에탄올의 첨가에 따른 유기산의 거동과, 반응증류에서 사용되는 triethylamine의 양과 반응시간에 대한 검토가 필요할 것으로 사료된다.

Precipitation and reactive distillation were employed to recover lactic acid from fermentation broth. Lime was initially added to fermentation broth in order to convert soluble lactic acid to an insoluble calcium lactate form. Drowning-out crystallization was used to decrease the solubility of calcium lactate by adding ethanol as a co-precipitant. In the ideal solution of organic acids as well as fermentation broth, precipitation experiments were performed with varying amounts of ethanol. Precipitation process was followed by reactive distillation. Carboxylate salts formed in the previous precipitation process were mixed with carbon dioxide and triethylamine to precipitate as calcium carbonate. The remaining liquid was distilled for 1 hr at different temperatures. Triethylamine and water were recovered from the top of the distiller, while organic acids, inducing lactic acid as a main component remained in feeding bottle. The yield of recovered lactic acid was 67.5% with the purity of 99.7%.

IFN-γ의 대량생산을 위한 기초연구로서 IFN-γ의 아미노말단에 glucagon과 ferritin을 융합파트너로 각각 결합시켜 재조합 IFN-γ의 발현을 유도하였다. 대장균 내에서 발현되는 IFN-γ는 그 자체로 매우 강한 소수성 결합의 양상을 나타내어 inclusion body 형태로 발현된다고 알려져 있으나 OrigamiTM(DE3) 균주로부터 50% 이상의 수용성 형태로 발현시켰다. IFN-γ로부터 융합파트너를 제거할 수 있는 system을 개발하기 위해 융합파트너와 IFN-γ 사이에 enterokinase cleavage site를 도입하였으며, enterokinase에 의해 IFN-γ에는 영향을 미치지 않고 효과적으로 융합파트너를 제거할 수 있었다. 재조합 IFN-γ의 분리 및 정제를 위해 발현벡터상의 융합파트너와 IFN-γ사이에 6X His-tag을 도입하였고 융합파트너의 N-말단에도 6X His-tag을 추가적으로 도입함 으로써 융합파트너와 더불어 enterokinase에 의해 분해되지 않은 융합단백질을 Ni-NTA agarose column으로 제거함으로서 IFN-γ를 완전 정제할 수 있었다. IFN-γ의 발현을 유도하는 발현유도체로서 15 mM lactose를 이용하여 5 L 발효조에서 IFN-γ의 발현을 검토한 결과, 재조합 균체의 단위건조질량 (dry cell weight, g)으로 약 11 g DCW/L 수준의 재조합 융합단백질을 얻을 수 있었다.

For the production of the recombinant human interferon-gamma (rhIFN-γ) in Escherichia coli, human glucagon and ferritin heavy chain were used as fusion partners. Even though rhIFN-γ is expressed as an inclusion body form in E. coli because of strong hydrophobicity of itself, over 50% of fused rhIFN-γ was expressed as soluble form in E. coli OrigamiTM (DE3) harboring pT7FH(HE)-IFN-γ which encodes ferritin heavy chain-fused rhIFN-γ. In the case of using glucagon-ferritin heavy chain hybrid mutant as a fusion partner, 6X His-tag was additionally introduced to N-terminus of GFHM(HE)-IFN-γ for enhancing purification yields of rhIFN-γ. Fusion protein HGFHM(HE)-IFN-γ with two 6X His-tag was more effectively bound to Ni-NTA agarose bead than GFHM(HE)-IFN-γ with a 6X His-tag. rhIFN-γ was completely purified from enterokinase-treated HGFHM(HE)-IFN-γ by Ni-NTA affinity column. For high-level production of rhIFN-γ, glucose was used as the sole carbon source with simple exponential feeding rate (2.4~7.2 g/h) in fed-batch process. The effective lactose concentration for the expression of the rhIFN-γ was 10~20 mM. Under the fed-batch culture conditions, rhIFN-γ production yield reached 11 g DCW/L for 6 hours after lactose induction.

재조합 생물의약품 생산시, 오염물질의 유래는 외인성(외래성 바이러스, 마이코플라즈마, 미생물) 및 내인성 (생산세포주 유래 단백질) 두 가지의 일반적인 가능성으로 존재한다. 이 중 생산세포주 유래의 불순 단백질은 환자에게 면역이상반응을 일으킬 수 있어 제품의 안정성과 사용자의 안전상의 문제가 될 수 있다. 따라서 이들 단백질의 오염 여부를 검출하는 방법의 개발이 요구된다. 상용화된 분석제품들은 일반적인 생산세포주 유래 단백질에 대한 분석은 가능하지만, 생산 방법이나 재조합 된 세포의 특성에 따라 달라질 수 있는 고유한 생산세포주 유래 단백질에 대한 분석은 적합하지 못하다. 본 연구에서는 재조합 항체의약품 생산과 정제과정에서 목적단백질의 생산 유전자를 지니지 않는 null cell mock 배양에 의해 생산세포주 유래 모든 단백질을 얻어 이에 대한 다클론항체를 제작하여 면역학적 반응을 이용하여 생산세포주 유래 단백질을 정량 할 수 있는 ELISA 방법을 개발하였다. 생산세포주 유래 단백질에 대한 다클론항체는 rabbit에서 얻었으며, 이 중 생산세포주 유래 단백질에 특이적인 항체만을 정제하였다. 또한 direct sandwich ELISA 방법 개발을 위해 항체에 발색효소 (HRP)를 표지하였다. 이렇게 만들어진 항체를 이용하여 정성분석을 위한 Western blot과 정량분석을 위한 ELISA 방법을 개발하여 목적단백질의 정제과정 내에서 생산세포주 유래 단백질이 제거되는 것을 확인하였다. 또한 개발된 ELISA 방법은 ICH 규정에 따라 validation을 실시한 결과 되어 객관적 검증을 받은 결과, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성의 기준을 만족하며 검출한도가 10.8 ppm인 방법임을 확인하였다.

The purpose of this study was to develop a assay system of host cell-derived residual proteins in final pharmaceutical products. Accurate and simple assay system for host cell-derived proteins (HCPs) is very important test item in pharmaceutical qualification control. In this study, methods for quantification of residual HCPs in recombinant anti-GPIIbIIIa antibody were developed using a process-specific immunoligand assay which was based on the Enzyme linked Immunosorbent assay (ELISA) system. The assay had a detection limit of 10.8 ng/ml of HCPs with a product concentration of 1 mg/ml. The practical implication of these results is that the developed ELISA system can be used for HCPs qualification control and this system will be applicable to develop another ELISA system of different antibody drug.

이온교환 크로마토그래피에서 주요 변수로 샘플 투입량, 용출 NaCl 농도, 용출액 pH를 변화시켜 lysozyme 크로마토그라피 실험을 하였다. 그리고 Aspen Chromatography simulator를 이용하여 위의 변수 변화에 대한 모사된 크로마토그램을 얻고 그 모사결과들을 실험 결과와 비교하였다. 용출 용액 NaCl의 농도가 높아질수록 단백질의 머무름 시간이 감소하며, 최대 피크의 높이가 높아졌다. pH가 증 가함에 따라 최대 피크 높이가 증가하며, 분리 시간이 앞으로 이동하였다. 단백질의 주입량에 따라 분리 시간에 상관없이 최대 피크 높이만 비례적으로 증가하는 것을 확인하였다. 그리고 실험을 통해 얻어진 결과와 시뮬레이션 결과의 비교를 통해 같은 경향을 보임을 확인하였다.

Lysozyme is an important antibacterial material, as effective food preservative. A number of lysozymes are found in nature such as egg white, where exists about 3.5% of egg proteins. In this study, carboxymethyl cation exchange chromatography has been used for separation of lysozyme. A simulation study by ASPEN was also performed for saving time and cost in chromatography purification experiments. Important parameters in experimental chromatography were sample loading amount, NaCl concentration, and pH of eluent. Simulation results were successfully fitted with chromatograms from experiments with change of parameters mentioned above.

전산모사 프로그램인 FEMLAB을 이용하여 chiral center를 가지고 있는 racemate인 ibuprofen의 R-form과 S-form의 분리 전산모사 결과와 Kromasil KR100-5CHI-TBB 칼럼을 사용하여 HPLC를 통한 실험데이터를 비교 분석하였다. Hexane / t-BME / acetic acid (45 : 55 : 1 v/v%)의 이동상의 조건에서 이론단수 (number of theoretical plates), 이론단높이 (HETP; Height Equivalent to a Theoretical Plate)을 구하여 축방향 확산계수 ( Deff i )를 계산하였다. PIM (Pulsed Input Method)을 사용하여 분석한 결과 ibuprofen의 농도가 증가할수록 Langmuir 등온흡착식을 따르는 비선형 거동을 보였고, 각 농도에서의 체류시간 ( t R )과 phase ratio를 이용하여 비경쟁적 Langmuir 등온흡착식의 매개변수를 추산하였고, 이 매개변수를 이용하여 경쟁적 Langmuir 등온흡착식을 결정하였다. 실험을 통해 얻은 데이터를 FEMLAB 적용하여 등온흡착식의 변화에 따른 용리띠의 변화와 두 성분이 컬럼을 이동하는 동안 두 성분간 분리 과정을 관찰하였다. Ibuprofen의 농도, 유속을 변화시키면서 실험결과와 전산모사결과를 비교한 결과 실험결과와 전산모사결과가 비슷한 경향성을 보였다. 이와 같이 FEMLAB 전산모사 프로그램의 실험적용 가능성을 확인하였고. 실험과 일치하는 전산모사데이터를 얻기 위해서 고정상내의 세공에서의 물질전달을 포함하는 물질수지식의 적용과 비선형 흡착평형식에 대한 좀 더 정확한 식이 요구된다.

FEMLAB is a powerful interactive environment for modeling, solving all kinds of scientific and engineering problems based on partial differential equations (PDEs). Separation process of chiral compound in HPLC columns was simulated by FEMLAB. To study change of elution profile with isotherm models, non-competitive and competitive Langmuir adsorption isotherm were adopted. Separated material was (R, S)-ibuprofen [(R, S)-2-(4-isobutyl phenyl) propionic acid], an anti-inflammatory agent, which retain the pharmacological activity in the (S)-(+)-enantiomer. Sample concentrations were changed from 0.5 ㎎/㎖ to 2.0 ㎎/㎖ at a flow rate of 1 ㎖/m in and flow rate varied from 1 ㎖/m in to 3 ㎖/m in at an ibuprofen concentration of 2.0 ㎎/㎖ and 20 ㎕ of injection volume. Simulated results were well fitted with experimental data.