Earticle

화석연료 기반의 산업이 현재 큰 위기를 맞고 있다. 이는 화석연료는 결국 고갈된다는 사실과 이에 따른 공급 불안 정 그리고 대기 중 이산화탄소 농도 증가 등의 문제에 기 인한다. 그러므로 탄소 중립적 (carbon neutral)이고, 재생 가능한 대체에너지가 필요하며 이는 환경적, 경제적으로 지 속 가능한 대안이어야 한다. 신 재생에너지 중 바이오디젤 (biodiesel)은 운송 연료로서 커다란 주목을 받고 있다. 그 러나 일반적으로 유지 식물로부터 생산이 되는 바이오디젤 로는 현재 운송 연료의 극히 일부만을 대체하고 있으며, 세계적인 운송 연료의 수요를 충족시키기 위해서 다양한 장 점을 가지고 있는 해양바이오매스 (marine biomass)인 미세 조류 (microalgae)를 바이오디젤의 원료로서 사용하는 것 이 최근에 대안으로 많은 사람들이 관심을 가지고 있다. 하지 만, 이를 실용화하기 위해서는 생산성을 높이기 위한 노력 이 더욱 필요하며, 아직 더 많은 집중된 연구가 요구된다.

The demand of biodiesel that is a renewable, alternative fuel for fossil-based petrodiesel seems to keep increasing. Exploiting lipids of microalgae as a raw material for biodiesel is already technically feasible. To realize economical production of microalgal biodiesel, several factors or strategies should be addressed and improved. Especially, researches on improvement of lipid synthesis by genetic or metabolic engineering are now in early stage, and prospects of this field are bright, requiring concerns and interests of many researchers to put practical use of microalgal biodiesel forward.

마이크로니들 테라피를 위한 발효 소재, 제품 개발 기술 은 피부 트러블 방지 등의 안전성과 우수한 피부 재생력 등의 약리적인 유효성이 필수적인 요소이다. 이 기술을 응 용하여 관련 산업 기술이 미비한 국내 시장의 활성화를 전 망하며 대형 다국적 기업이 세계 시장을 점령하고 있는 상 황에서 자유무역협정 (FTA) 체결의 확대로 인해 가격과 품질 경쟁력을 갖춘 외국 제품이 국내로 유입될 경우 대부분 시장을 잠식할 것으로 예상된다. 현재도 국내 제품보다 우 수한 품질을 보유하고 있는 외국 제품이 일부 대형 병원 중심으로 유통이 되고 있으나 고가의 가격으로 인하여 확 산세는 저조한 편이다. 인체의 안전성과 효용성이 확립된 미세침 미용 제품의 경우에는 생약박피, 화학박피 등 각종 필링 후에 재생 및 항상성을 유지하기 위해 사용되어질 수 있으며 physical approach로 iontophoresis, 고전압을 이용한 약물침투법인 electroporation, 초음파를 이용한 sonophoresis, tape stripping 이나 물리적 방법을 이용하여 각질층을 제거하는 stripping of stratum corneum 등 치료, 미용의 목적으로 직간접인 응 용이 가능할 수 있다. 또한 의료용 기구인 마이크로 니들의 활성화, 진일보한 발 효 기술 확립, 생약제재 이용으로 인한 천연물과 곡물류의 소비 증대 등 의약품, 의료기구, 화장품 분야에서 상호 시 너지 효과를 얻을 수 있을 것으로 추측된다. 코슈메슈티컬 제품은 상대적으로 의약품이나 의약외품 에 비교하여 시간과 비용적인 측면에서 경쟁력이 있는 제 품의 개발이 가능하고 저렴한 투자비용으로 고부가가치의 제품을 개발할 수 있으며 첨단 미래형 바이오산업으로 육 성할 수 있다. 특히 식약청이 2009년 11월 18일 ‘화장품 원료지정에 관한 규정’의 개정고시를 통해 2009년 상반기 화장품 배 합금지원료로 지정해 입안 예고한 바 있는 ‘인체 줄기세포 및 유래물질’ 관련 조항을 삭제하므로써 인체 줄기세포 배양액은 화장품 소재로써의 사용이 가능하게 되었다. 또 한 활발한 연구가 진행 중인 제 3세대 소재인 peptide는 의약품뿐만 아니라 생명과학 연구개발 분야나 기능성 화 장품 분야 등에서도 그 수요가 크게 확대되어 바이오산업 에서의 중요성과 잠재력이 부각되고 있으므로 이러한 소재 를 이용한 코슈메슈티컬 제품 개발은 더욱 활발해질 것 으로 기대된다. 다만, 침습적인 방법에 의해 피부에 직접 적용되는 솔루 션은 반드시 임상적 접근이 필요하며 화장품의 경우 경피 에 잔존율이 높은 일반 화장품보다는 피부 침투에 의해 발 생될 수 있는 문제를 해결하기 위한 높은 안전성이 요구된 다. 그리고 또한 의료용 기구와의 상관성 또한 면밀히 검 토한다면 효능, 효과를 더욱더 높일 수 있을 것이며 경쟁 력 있는 분야로 영역을 확대해 갈 수 있을 것이다. 미세침 롤러 등의 경피 흡수 제제 관련 산업 분야는 80년 대의 10~100편의 논문, 특허가 90년대에는 100편 이상 발 표되는 등 활발한 연구 활동으로 미래 지향적인 산업 분야 로 발전되고 있다.

Fermented materials have been used for long time around the world and have been researched according to the excellent effect in the part of medical and food industry. However, when such materials are applied on skin, because of the skin barrier, the most effective ingredients are poorly absorbed. The absorption of the skin is exceedingly limited and the method of increasing skin absorption needs special procedures. The micro-needle therapy is a method used to improve the absorption of drug (solution) in the skin which is called “natural skin rejuvenation therapy”. This therapy uses micro-needle which is equipped with very thin, delicate needles smaller than a 0.07 mm thick hair. During this therapy, the micro-needle makes small holes and helps absorb the solution into the skin. This is a very excellent therapy in skin absorption. It can be used in wide regions of the skin without any side effects and no recovery time. In 2007, the micro-needle is permitted to personal care. However, the solutions have not yet been developed professionally, and such skill is needed.

항진균성 항생물질에 대한 연구는 동물이나 인체의 진균 성 질환의 치료 목적으로 1960년대 이후부터 활발히 추진 되었으며, 더불어 각종 농작물의 병충해 방제, 항생물질을 이용한 농산물 가공 및 식품의 방부 보존에서도 그 유효성이 입증되어 제약관련 연구기관을 포함하여 다양한 분야에서 연구되고 있는 실정이다 [1,2]. 현재 임상용으로 사용하는 다양한 의약용 항생제들이 천연자원에서 선도물질이 분리 되었으며 [3], 그 외에도 다양한 유효성분에 대한 분석은 국내외 학계에서 꾸준히 연구되고 있는 부분이다. 진균류는 인체의 면역기능이 약화된 경우에 감염되기 쉬 우며, 항생물질 및 항암제 등의 오남용으로 인해 항균제 내성이 생겼을 때는 치료가 어려운 진균증을 유발하여 국부 또는 전신적인 피부질환을 일으키거나 호흡기 및 소화기 계통의 급만성 질환을 일으킨다 [4]. 대표적인 진균증으로 는 candidiasis, asperillosis, penicilliosis, dermatophytosis 등이 있으며, Trichophyton sp., Epidermophyton sp.와 같은 사상균은 인체에 표재성 진균감염증을 유발하는 사상균으 로 모발, 피부, 손톱과 같은 조직의 각질층에 침투하는 능 력을 가지고 있다 [5-7]. 항진균성 물질은 진균의 생육을 억 제하거나 사멸시키는 물질로 오랫동안 진균감염의 치료제로 사용되고 있는 amphotericin B, flucytosine과 griseofulvin를 포함하여, 근래에는 itraconazole, ketoconazole 및 fluconazole 등 다양한 항진균제가 개발되어 사용되고 있다 [8,9]. 최근 에는 triazoles (voriconazole, ravuconazole 및 posaconazol) 과 echinocandin제제 (caspofungin, anidulafungin 및 micafungin) 등 다양한 항진균제가 개발되고 있다 [10]. 그러나 다양한 병원균의 출현 및 항생제 내성을 가진 균 주들이 지속적으로 보고됨에 따라 다양한 천연물질을 이용 한 새로운 항균물질 개발에 대한 연구는 끊임없이 진행되 고 있다 [11]. 또한 이러한 화학물질과 과도한 항생제의 사용은 부작용과 안정성에 문제를 야기시키고 있는데, amphotericin B를 비롯한 몇 종의 물질은 인체에 대한 독 성이나 물에 대한 용해성이 낮은 관계로 사용에 만족스럽 지 못한 것으로 평가되고 있다 [12-14]. 또한 griseofulvin 은 candidasis에 효과가 없으며, 후천성 면역결핍증 환자 에서 발생한 oropharyngeal candidiasis (재발성 구인두 칸디다증)의 치료를 위해 fluconazole을 장기투여한 경우 fluconazole 내성 Candida albicans의 출현이 다수 보고됨 에 [15,16] 따라 이를 대체할 만한 천연 항균물질에 대한 연구가 절실한 실정이다. 이에 본 연구에서도 독성이 적고 항진균성 활성이 강력 한 항생물질을 개발하기 위한 일환으로 토양에서 항진균 성 물질을 생산하는 균주를 선별하던 중 인체 진균증을 유발 하는 C. albicans, T. mentagrophytes 그리고 Trichophyton rubrum에 대해 효과가 있는 Bacillus sp. BCNU 2002를 분 리하였다. Bacillus sp. 균주의 다양한 생리활성물질에 관한 연구는 이미 많이 보고되어 있으며, 항생작용에 관한 연구는 식물병 원균의 생육을 저해시키는 항진균 물질에 관한 연구 [17-20] 가 주를 이루고 있다. 또한 Bacillus 균주가 생산하는 단백 질 가수분해효소는 이미 식품공업, 의약공업 및 세제공업 등 효소 전체 시장의 60% 차지할 정도로 다방면으로 응용 되고 있는 이용가능성이 높은 균주이다. 그러나, 피부질환 원인균 저해에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구팀에서는 태백산에서 분리한 Bacillus sp. BCNU 2002의 균 배양액으로 1차 항균스펙트럼을 조사하였고, 항균물질 분리를 위해 배양액을 ethyl acetate 추출물과 펩 타이드 추출물로 나누어 각각 평판배지확산법과 액체배지 감수성 실험을 통하여 그람 양성 및 그람 음성 세균 특히 진균에 대한 항균활성을 측정하여, 항생물질 개발을 위한 기초 결과로서 보고하고자 한다.

An endospore-forming, rod-shaped bacterium was isolated from forest soil samples collected at the Taebaek mountain of Gangwon province, Korea, and taxonomically characterized by physiological, biochemical and phylogenetic methods. Its 16S rRNA sequences showed the maximum similarity of 97% with B. amyloliquefaciens. In addition, the isolate BCNU 2002 was determined to have the ability to produce enzymes such as amylase, protease, gelatinase and catalase. The in vitro antifungal activity of Bacillus sp. BCNU 2002 was also examined against human pathogenic fungi such as Aspergillus niger, Candida albicans, Epidermophyton floccosum, Saccharomyces cerevisiae, Trichophyton mentagrophytes and Trichophyton rubrum. A maximum production level of antifungal substances of Bacillus sp. BCNU 2002 was achieved under aerobic incubation at 28℃ for 7 days in LB broth. BCNU 2002 showed strong antifungal activities against T. mentagrophytes and T. rubrum with the range of percentage inhibition from 56.25 to 63.23%. It was also confirmed that ethylacetate extract of cultured broth showed a strong antifungal activity against A. niger, C. albicans, S. cerevisiae and T. rubrum by agar diffusion method. The peptide fraction also exhibited broad antifungal spectrum against various pathogenic fungi. The minimum inhibitory concentration values for active extracts ranged between 125 μg/mL and 1000 μg/mL.

아스타잔틴 (astaxanthin, 3,3’-dihydroxy-β,β’-carotene- 4,4'-dione, C40H52O4, FW 596.9)은 자연계에 널리 존재하는 케토-카로티노이드 (keto-carotenoid)로서 polyisoprenoid와 oxygen quenching 기능을 가진 benzenoid ring의 결합 구 조로, 베타카로틴 (β-carotene)과 매우 유사한 구조를 지니 고 있다. 아스타잔틴은 주황색 또는 붉은색의 색소 물질로 갑각류 등 다른 해양생물과 조류에 존재하고, 비타민 E인 알파-토코페롤 (α-tocopherol)에 비하여 550배에 해당하는 효과가 입증되어 있는 강력한 항산화 물질이다 [1]. 아스타 잔틴의 강력한 항산화활성은 구조의 C-4, C-4'에 위치한 oxo-group 때문이라고 보고되어 있고 [2], 아스타잔틴의 항산화 기작은 일중항 산소 (singlet oxygen)를 제거하거나 [3] 자유라디컬 소거능 [4,5], 과산화물 연쇄반응 (peroxide chain reaction)을 정지시키는 것으로 알려져 있다 [6,7]. 아스타 잔틴의 항산화 작용은 일중항 산소의 제거에 의해 항암에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그 예로 아스타잔틴의 활 성산소 (oxygen radical) 제거에 의한 개시 (cancer initiation) 와 진행 (propagation)의 과정을 감소시켜 난소암, 간암에 대한 예방효과 등이 보고된 바 있다 [8-10]. 이 외에도 아 스타잔틴의 항암효과에 대한 많은 연구결과가 보고되었 다 [11-15]. 또한 아스타잔틴은 면역기능에 활성이 있는 것 으로 알려져 있고 [16-21], 심장질환에 대한 치료효과도 보 고되었다 [22,23]. 이 외에도 항염증 효과 [24], 자외선 차단 효과 [25], 눈 기능과 관련된 효과 [26-29], 간기능에 대한 영향 [30]이 보고된 바 있다. 또한, 아스타잔틴의 미백활성 이 미백제로 알려진 kojic acid와 비슷한 활성을 지니는 것 으로 보고된 바 있다 [31]. 현재까지의 연구결과들이 아스타잔틴의 높은 생리활성 을 입증하고 있고, 여러 천연자원에서 아스타잔틴의 추출 법 등의 연구가 활발히 이루어지고 있지만, 아스타잔틴은 이중결합을 가진 불포화화합물로 제조나 저장 시 열과 산화 (빛)에 의해 쉽게 파괴되어 활성이 감소하여 응용범위에 한 계가 있는 실정이다 [32]. 현재 국내외적으로 아스타잔틴의 안정성과 용해도 개선을 위한 제형화 연구는 미비한 실정이다. 국내에서는 아스타 잔틴을 수용화하기 위한 방법으로 키토산 등 수용성 고분자 를 이용한 연구를 진행하였으나, 현재 실용화되지 않은 상태 이고, 그 안정성이나 효능 또한 입증되지 않았다 [33]. 또한 안정성 향상의 측면에서 아스타잔틴 유액제조에 의한 안정성 향상이 보고된 바 있고 [34], chitosan matrix를 이용하여 아스타잔틴을 캡슐화하여 온도에 대한 저장성 개선 [35], 키토산을 이용하여 헤마토코커스로부터 추출한 아스타잔틴 을 캡슐화하여 산화안정성 개선과 저장에 따른 항산화활성 이 보고된 바 있다 [36]. 현재까지 국내외적으로 아스타잔틴 제형화 연구는 초기 상태이고 안정성과 용해도를 동시에 높일 수 있는 기술은 보고된 바 없다. 아스타잔틴을 식품 및 화장품으로 용도개발하고 이와 관련된 기술적인 문제를 해결 하기 위해서는 제조 및 유통과정에서 변질되지 않고 본래 의 활성이 유지될 수 있도록 하는 안정화 기술 즉, 화장품의 제형기술이 요구된다. 최근에는 화장품의 유효성분을 유지하면서 안정하게 피부에 흡수시킬 수 있는 피부 경피흡수시스템으로써 리포좀 제형에 대한 관심이 높아지고 있다. 리포좀은 자기 스스로 회합하는 콜로이드 입자들의 구형 인지질 베지클로 정의되는데 1960년대 초 Alec Bangham은 물 속에서 인 지질 베지클 구조로 형성되는 것을 처음으로 발견하였다 [37]. 리포좀은 인지질로 구성된 구형의 소포체 (vesicle)로서 친수성 및 친유성 성분을 동시에 포집할 수 있어 vitamin, 약품 등과 같은 활성성분에 대한 전달체 (delivery system) 로 많은 연구가 진행되고 있다 [38]. 인지질은 생체막의 주요 구성성분이기 때문에 리포좀의 인지질막 또한 생체 막과 유사한 생리학적 기능 및 특성을 나타낸다. 따라서 리포좀은 피부 친화적이며 안전성이 우수하기 때문에 제약 및 화장품산업 분야 등에서 효과적인 약물전달체 로서 응용되고 있다 [39]. 주름을 개선하거나 미백작용 을 높이는데 특수한 효과를 얻기 위해서 활성물질들을 피부에 투과시킬 목적으로 리포좀 전달체계 시스템을 사용해 왔으며 [38], 활성 물질 중 다양한 생리적 기능 을 가진 ascorbic acid는 피부의 미백작용과 주름 개선에 우수한 효능을 갖고 있지만 화학적으로 불안정하여 물 이나 공기와 접촉하게 되면 산화되어 그 활성이 감소 하는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 리포 좀내에 ascorbic acid를 포집시켜 안정성 향상이 보고 된 바 있다 [40]. 리포좀 제형에 나노기술을 적용하게 되면 특정 성분을 피부 속에 전달하는 역할을 하는 나노구조체의 크기가 피 부를 구성하는 세포보다 작기 때문에 나노입자가 포함된 기능성 화장품을 바르면 약효 성분이 피부 깊숙이 잘 스며 든다고 알려져 있다. 본 연구에서는 이중결합을 가진 불포화화합물로 제조나 저장 시 열과 산화 (빛)에 의해 쉽게 파괴되어 활성이 감소 하여 응용범위에 한계가 있는 아스타잔틴을 안정성이 우수 한 기능성 원료로써 산업적으로 용도를 넓히고 부가가치를 향상시키는 것을 목적으로 나노리포좀 제형기술을 이용하 여 접목하였다.

Astaxanthin is an unsaturated compound with a double bond. So it is easily decayed by heat and oxidation (light) during its storage and processing of it. Nanoliposome formulation technology was utilized to improve the stability of astaxanthin. Nanoliposome preparation conditions were established and the stability of astaxanthin encapsulated nanoliposome and free astaxanthin was investigated. Thermal stability and UV-stability of astaxanthin encapsulated nanoliposome increased up to two times and tree times, respectively. Astaxanthin encapsulated nanoliposome could be used as a stable functional material for industrial purposes.

구연산 (citric acid, 3-hydroxypentanedioic acid-3-carboxylic acid, C6H8O7)은 수산기를 가지고 있는 다염기의 carboxylic acid의 일종으로 (Fig. 1) 물에 잘 녹고 상쾌한 신맛을 내며, 생체 내에서는 tricarboxylic acid (TCA) 회로를 구성하는 한 요소로서 고등동물의 물질대사에서 중요한 작용을 한다 [1,2]. 체내 근육 속에 유산이 쌓이면 피곤함을 느끼게 되며, 이때 구연산을 섭취하면 TCA 회로를 통하여 유산을 탄산가스와 물로 분해해서 몸 밖으로 배설시킨다. 구연산이 함유된 청량 음료나 구연산이 풍부한 과일을 섭취하면 피로회복에 도움 이 된다. 구연산은 스웨덴의 화학자인 Carl Wilhelm Scheele 에 의해 레몬주스로 부터 처음으로 분리 정제되었으며, 그 외형은 결정성의 백색 가루로 되어 있고 물에 잘 녹는다. 체내에서 구연산은 체내의 칼슘흡수를 촉진시키는 작용을 하며 [3,4], 살균효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 구연 산은 과일로부터 추출하여 청량음료나 식품첨가제로 사용 해 왔으나, 근래에는 당류 (예, 전분이나 전분박)를 기질로 하여 미생물의 발효를 이용하여 만들고 있다 [5-6]. 구연산 의 용도로는 전 세계 사용량의 50% 이상이 과즙, 청량음료, 이뇨성 음료에 신맛을 내기 위한 식품첨가제로서 주로 사용 되고 있다. 그 외에도 산성세제 제조용 유기산 첨가제, 부식 방지제, 살균 보조제, 금속광택제 및 제약 산업 등 그 응용 범위가 확대되고 있다 [7-8]. 그러나 구연산은 신맛이 강하여, 과즙, 음료, 식품에 첨가 시에 이 신맛을 보상하기 위하여 당을 과량으로 첨가해야 하거나 수용액 상태에서 안정성이 떨어지는 등의 보완해야 할 점이 있다. 종래의 구연산 관련 기술은 일반적인 구연산의 제조방법 또는 구연산 함유식품 의 제조방법에 국한되어 구연산의 강한 신맛을 감소시킬 수 있는 제조기술은 미미한 실정이다. 구연산을 포함하여 휘발성이 있는 향기성분이나 불안전한 영양성분이 특정 환 경에 그대로 노출되면 일반적으로 외부 환경에 따라 휘발, 산화 및 수분흡수 등이 일어나 물질의 특성 변화가 촉진될 가능성이 높아진다. 이러한 물질들을 외부환경으로부터 보호 하여 물질의 특성 변화를 최소화 하고, 반응성이 큰 물질들 을 격리시키며, 용해도를 조절하며, 또한 강한 맛을 감소시 키는 방법으로 그 물질을 내부에 가두고 외부를 코팅하여 캡슐화 시키는 기술이 이용될 수 있다 [9-11]. 일반적으로 광범위하게 사용되고 있는 코팅 캡슐화 공정은 분무건조방 법으로서, 코팅 물질을 수화시킨 후 대상물질을 분산시켜 그 혼합물을 고온의 chamber내로 분무하는 방법으로 주로 향미성분이나 오일을 캡슐화 하는데 사용된다 [9]. 분무건조 방법은 물을 용매로 사용하여 잔존하는 용매에 대한 염려 가 없으나 chamber의 온도가 100~180℃ 정도가 되어 열에 약한 물질은 피복과정에서 분해의 우려가 있다. 이를 보완 하기위하여 에탄올을 건조 매체로 하여 50℃ 이하에서 건조 하는 방법도 알려져 있다 [10]. 이밖에 suspension process, extrusion 등의 공정이 있으며, 캡슐화 공정은 핵심물질의 성질과 코팅물질의 구조적 특징, 물리 화학적 특성 등을 고려하여야 성공적으로 달성될 수 있다 [11]. 본 연구는 신맛이 요구되는 식품에 일반적으로 첨가되는 구연산의 산미 기능과 물성을 향상시키기 위하여 정제 대 두유 (purified soybean oil)와 카나우바왁스 (carnauba wax) 등의 식물성 소재를 이용하여 구연산 분말을 유동공기로 유동시키면서 일정한 유동흐름을 만들고 코팅물질인 정제대 유나 왁스 등을 충분히 예열시켜 녹인 후 분무노즐을 통하 여 분사시켜 높은 수율을 얻을 수 있는 구연산 코팅 (코팅 율 95%이상) 제조공정을 개발하였다. 제조된 코팅구연산 (coated citric acid)을 식품에 적용 시켰을 때 최종제품에서 본 식품의 물성을 변화시키지 않고 전체적인 제형이 조화 를 잘 이루었으며, 제품이 입에서 녹을 시점에서 자극적이 지 않은 신맛을 최대로 방출하는 특징을 기대할 수 있다. 코 팅 구연산은 껌, 제과 외에도 다양한 식품산업 및 향장산업 에 적용 가능할 수 있을 것으로 사료된다.

Citric acid is a natural preservative and is used to add a sour taste to foods and soft drinks. For the preparation of stable food additives of citric acid, a coating process using vegetable oil was developed. Coating materials used were purified soy bean oil and carnauba wax. The yield of coated citric acid was up to 95% in both cases. The contents of coating materials was 20~33% in the total composition and the coating efficiency was 95.2 ± 0.01%. The surface of coated citric acid was much smoother and more homogeneous than that of original citric acid according to SEM data. The coated citric acid can be used to as a stable food additive and also would be applied to nutraceuticals and cosmetic ingredients.

광범위한 약리작용을 가지고 있어 질병의 치료 및 예방 에 효과가 있는 천연물 중 가장 주목받고 있는 약용버섯은 분류학상 균류 (Fungi) 중 진균류 (Eumycetes)에 속하며 대부분은 담자균류 (Basidiomycetes)의 일종이다 [1,2]. 최근 담자균류 유래 약용버섯들의 항암효과가 과학적으로 입증 되고 있으며 [3,4], 약용버섯 추출물 중에서 특별히 면역증 강작용에 의해 탁월한 항암효능과 당뇨병 개선효과를 보이 는 생리활성물질은 β-D-glucan 구조를 갖는 수용성 단백다 당체 (향후 “단백다당체”로 명명함)로 구성되어 있음이 밝 혀졌다 [5,6,7,8]. 표고버 섯균사체 추출물의 경우 면역증 강효과로 인해 기능성 식품과 암치료 (보조)제 의약품으로 사용되고 있다. 이 버섯의 자실체에서 추출한 단백다당체 역시 항암성 면역증강제인 Lentinan 주사제로 판매되고 있 다. 이 외에도 액상배양된 운지버섯 균사체에서 추출한 단백 다당체 (PSK 및 Krestin)는 항암성 면역증강제로, 치마버섯 균사체 배양시 생합성되는 세포외다당체 (exopolysaccharides) 역시 동일한 효능의 주사제 (Shizophyllan)로 판매되고 있다. 학명이 Inonotus obliquus로 불리는 차가 (Chaga, Tchaga) 버섯은, 나무줄기나 그루터기에 자생하는 백색부후균의 일종 으로, 1년에 0.9 cm 이하로 자라는 매우 귀한 약용버섯이다. Inonotus obliquus 유래의 대표적인 생리활성물질인 단백다 당체의 경우 항당뇨 효과 [9] 및 면역증강 효과로 인한 항암 효과가 뛰어난 것으로 이미 오래 전에 입증된 바 있는데 [10,11,12], 이러한 단백다당체는 특별히 고안된 정제과정을 거쳐 정제될 경우 건조중량의 5% 이하의 함량을 나타내는 미량성분이다 [13,14]. Inonotus obliquus는 최소 5년 이상 성장해야 포자가 형성되고, 통상 10~20년 이상 자라야 채집 이 가능한 것으로 알려져 있다. 이처럼 차가버섯 자실체의 까다로운 성장조건으로 인해 생산성이 매우 낮으므로, 정품 의 야생 차가버섯을 구입하기가 쉽지 않고, 그 가격 또한 매 우 비싼 실정이다. 한편 차가버섯 자실체의 고체배양에 의해 단백다당체를 생산하는 방법은 대량생산 시 품질관리가 힘 들며 자실체 재배를 위한 많은 노동력과 시간이 요구됨에 따라 생산성도 떨어지는 단점이 있다 [15,16]. 반면에 차가버섯 균사체 액상배양을 통한 단백다당체 생산공정은 기존의 자실체 배양을 통해 생산하는 방법에 비 해 보다 잘 규명된 조건하에서 대량 생산이 가능하며 배양 기간 또한 단축시켜 생산성을 크게 높일 수 있는 장점이 있다 [17,18,19]. Inonotus obliquus 균사체의 액상배양에 의한 단백다당체의 산업적인 대량생산을 위해서는 고생산성 균주의 확보가 핵심적인 관건이다. 고생산성 균주를 개발 하기 위해서는 최종 생산배양에서 선별된 균주들의 단백다 당체 생산성을 확인해야 하는데, 이를 위해서는 다음의 일련 의 배양공정을 거쳐야 한다: 단일 콜로니를 얻기 위한 원형 질체 형성 및 재생, 고체성장배지에서의 계대배양 (고체성 장배장), 정치배양, 플라스크에서의 액상 성장배양을 거쳐 최종적으로 플라스크 또는 발효조애서의 액상 생산배양. 이 일련의 배양공정에서 균주개발 시 가장 큰 장애요인은 고체 성장배지에서의 계대배양 (이후 “고체성장배양”)인데. 그 이유는 이 배양 단계에서 특별히 장기간의 배양 시간이 요구 되어 신속한 균주개발이 매우 어렵기 때문이다. 본 연구에 서는 고체성장배양 시의 이러한 문제점을 극복하고자, 배양 환경의 최적화에 대한 연구를 중점적으로 수행하였다. 본 연구팀은 실제로 원형질체 형성을 통한 균주 개량에 관한 연구를 통해, 고체성장배양에서 훌륭한 성장 특성을 보이 는 균주들이 최종 액상 생산배양에서도 단백다당체의 생산 성이 높음을 확인한 바 있다 [20]. Inonotus obliquus 균사체와 같은 균사형성 고등균류의 경우 배지성분에 따라 배양 생리적 및 배양 형태적 특성이 확연히 달라진다. 따라서 고생산성 균주의 신속 선별을 위 해서는 고체성장배지에 포함되는 영양원의 성분 및 조성의 최적화가 필수적이다. 배지 최적화를 수행할 때 단일 요소 에 대해서만 변화를 줄 경우, 영양원 간의 상호작용을 제 대로 파악할 수 없으므로 최적 배지조성을 찾기 힘들며, 여러 요소를 전체적으로 조사할 경우 과다한 실험양으로 인한 한계에 직면하게 된다. 이러한 어려움을 해결하기 위 해 본 연구에서는 유용대사산물의 생물공학적 대량생산을 위해 주로 사용되는 통계적 배지최적화 방법을 도입하였다 [21,22,23]. 즉 고체성장배지의 조성을 최적화하기 위해 균 체의 성장속도에 큰 영향을 미치는 주요 배지성분들을 우 선 찾아내고, 그 성분들의 교호작용을 확인하기 위한 다양 한 통계적 실험방법들을 순차적으로 적용한 후, 최종적으 로 반응표면분석법을 적용하여 균사체의 성장속도가 최대 가 되는 배지조성을 결정하였다.

The protein-bound innerpolysaccharides (IPS) produced by suspended mycelial cultures of Inonotus obliquus have promising potentials as an effective antidiabetic as well as an immunostimulating agents. To enhance IPS production, intensive strain improvement process should be carried out using large amount of UV-mutated protoplasts. During the whole strain-screening process, the stage of solid growth-culture was found to be the most time-requiring step, thus preventing rapid screening of high-yielding producers. In order to reduce the cell growth period in the solid growth-stage, therefore, solid growth-medium was optimized using the statistical methods such as (i) Plackett-Burman and fractional factorial designs (FFD) for selecting positive medium components, and (ii) steepest ascent (SAM) and response surface (RSM) methods for determining optimum concentrations of the selected components. By adopting the medium composition recommended by the SAM experiment, significantly higher growth rate was obtained in the solid growth-cultures, as represented by about 41% larger diameter of the cell growth circle and higher mycelial density. Sequential optimization process performed using the RSM experiments finally recommended the medium composition as follows: glucose 25.61g/L, brown rice 12.53 g/L, soytone peptone 12.53 g/L, MgSO4 5.53 g/L, and agar 20 g/L. It should be noted that this composition was almost similar to the medium combinations determined by the SAM experiment, demonstrating that the SAM was very helpful in finding out the final optimum concentrations. Through the use of this optimized medium, the period for the solid growth-culture could be successfully reduced to about 8 days from the previous 15~20 days, thus enabling large and mass screening of high producers in a relatively short period.

천연물 유래 생리활성물질 및 기능성 식품의 개발을 통 한 질병의 치료 및 예방에 탁월한 효과가 있는 것으로 알 려져 있는 약용버섯은 분류학상 균류 (Fungi) 중 진균류 (Eumycetes)에 속하며 대부분은 담자균류 (Basidiomycetes) 의 일종이다 [1,2]. 약용버섯은 단백질, 아미노산, 비타민, 무기염류, 당 등과 같이 인체에 중요한 각종 영양성분을 함유하고 있고 광범위한 약리작용을 가지고 있어 전통적 으로 민간의약 제제로 널리 활용되어 왔다 [3,4]. 최근 여러 종류의 버섯자실체 및 균사체 추출물 중에서 특별히 면역증 강작용에 의해 탁월한 항암효능과 당뇨병 개선효과를 보이 는 생리활성물질은 β-D-Glucan 구조를 갖는 수용성 단백다 당체 (향후 “단백다당체”로 명명함)로 구성되어 있음이 밝 혀졌다 [5,6,7,8]. 일본의 경우 기능성 식품으로 표고버섯 균사체 추출물이 이미 일반화 되어 있으며, 의약품의 경우 면역증강효과에 의한 암치료 (보조)제로 사용되고 있다. 구름 (운지)버섯 배양 균사체에서 추출한 단백다당체인 PSK는 항암성 면역증강제인 Krestin으로, 치마버섯 균사체 배양의 배양여액에서 추출한 세포외다당체인 Shizophyllan 은 항암성 면역증강제인 Sizofilan 주사제로, 그리고 표고 버섯 자실체에서 추출한 단백다당체는 항암성 면역증강제 인 Lentinan 주사제로 판매되고 있다. 항당뇨효과 및 항암효과가 특히 뛰어난 것으로 알려진 세포벽 단백다당체 (innerpolysaccharides) (IPS) [9]의 생 산균주이며 담자균류에 속하는 Inonotus obliquus는 최소 5년 이상 성장해야 포자가 형성되고, 통상 10~20년 이상 자라야 채집이 가능한 것으로 알려져 있다. 담자균류의 면 역증강 작용의 항암성분 [10,11,12]으로 밝혀진 IPS는 특 별히 고안된 정제과정을 거쳐 정제된 조단백다당체 내에 도 5% 이하의 함량을 나타내는 미량성분이다 [13,14]. 최 근 들어 인공재배에 의해 자실체를 생산하고 있으나 긴 생산기간과 낮은 생산성으로 인해 소비자가 원하는 저렴 한 가격에 판매가 어려운 실정이다. 현재까지 I. obliquus 에 대한 대부분의 연구는 고체배양을 통하여 얻어진 자실 체 추출물의 약리작용 및 약효성분, 구조분석에 관한 것이 주를 이루고 있을 뿐 액체배양을 통하여 균사체를 대량으 로 배양하고 이로부터 IPS를 대량 생산하는 연구는 부족 한 실정이다. 자실체의 고체배양에 의해 IPS를 생산하는 방법은 대량생산 시 품질관리가 힘들며 자실체 재배를 위 한 많은 노동력과 시간이 요구됨에 따라 생산성도 떨어지 는 단점이 있다 [15,16]. 이와는 대조적으로 균사체 액상 배양을 통한 IPS 생산공정은 기존의 고체배양을 통해 자 실체를 생산하는 방법에 비해 보다 잘 규명된 조건하에서 대량 생산이 가능하며, 배양기간 또한 단축시켜 생산성을 높일 수 있는 장점이 있다 [17,18,19]. I. obliquus 균사체의 액상배양에 의한 단백다당체의 산 업적인 대량생산을 위해서는 고생산성 균주의 확보가 핵 심적인 관건이다. 고생산성 균주를 개발하기 위해서는 최 종 생산배양에서 선별된 균주들의 IPS 생산성을 확인해야 하는데, 이를 위해서는 다음의 일련의 배양공정을 거쳐야 한다: 단일 콜로니를 얻기 위한 원형질체 형성 및 재생 - 고체성장배지에서의 계대배양 - 정치배양 - 플라스크에서 의 성장 액상배양 - 플라스크 액상 생산배양 또는 발효조 액상 생산배양. 본 연구에서는 I. obliquus 균사체의 액상 배양에 적합하고, 동시에 IPS 고생산성의 특성을 갖는 우 량균주를 획득하는 방법을 개발하고자 하였다. I. obliquus 의 경우 균사체 액상배양 시 포자를 형성하지 않기 때문 에 동일한 유전자를 보유한 단일균주의 선별이 어려운데, 배양공정의 안정성과 재현성을 위해서는 고생산성의 단일 균주 개발이 필수적이다. 따라서 본 연구에서는 균사체로 부터 세포막을 제거하여 형성된 원형질체로부터 단일 핵 을 보유한, 성장속도가 우수한 우량 균주를 선별하여, 이 로부터 유효성분인 IPS를 고함유하는 고생산성 균주를 개 발하고자 하였다. 이를 위해 원형질체 재생을 위한 재생배 지 및 고체 성장배지에서 빠른 성장속도를 보이는 생산균 주를 분리하여 플라스크 액상 생산배양을 통해 이들의 배 양 생리적 특성을 재조사한 후, 이로부터 IPS 고생산성의 생산균주를 최종 선별하고자 하였다.

Studies on the production of cell-wall bound innerpolysaccharides (IPS) (soluble β-D-glucan) have been performed by use of suspended myelial cultures of Inonotus obliquus. This product has promising potentials as an effective antidiabetic as well as an immunostimulating agents. As a first step to enhanced production of IPS, Intensive strain improvement programs were carried out by obtaining a large amounts of protoplasts for the isolation of single cell colonies. Rapid and large screening of high-yielding producers was possible because about fivefold higher amount of protoplasts (2.3 x 106 protoplasts/mL) could be recovered with relatively high regeneration rates of 10-2~10-3 by applying a modified filtration method, as compared to the previously used trapping method. A basic protocol necessary for UV-mutation of the protoplasts was also developed, resulting in several overproducing variants with good fermentation properties. Since the amount of IPS extracted from the mycelial cell walls of I. obliquus turned out to be almost constant per g DCW, increase in cell mass was considered the most important factor for the enhancement in IPS production. Therefore, attempts were made to screen mutant cells showing rapid mycelial growth rate in the final suspended cultures. Notably, the mutant strains showing an active cellgrowth in the preceding solid growth cultures were observed to produce higher amount of IPS in the suspended fermentations as well. A striking mutant, OBLQ756-15-5 strain, obtained from the survivors of a harsh UV-treated condition (97% death rate) was found to stably produce as high cell mass as 22 g DCW/L in the final fermentations. Currently, this strain is being tested for development of a scaled-up fermentation process for mass production of IPS.

토양 원핵 미생물인 방선균은 포자를 형성하는 그램 양성 의 박테리아로서 현재 인류의 질병치료에 사용되고 있는 항생물질의 70%를 생산하는 유용한 미생물이다. 그러나 식물에 피해를 주는 경우도 있는데 감자 더덩이병의 원인 물질인 thaxtomin을 생산하는 방선균들 (Streptomyces scabiei, Streptomyces scabies, Streptomyces. acidiscabies, Streptomyces. turgidiscabies)이다 [1,2]. Thaxtomin은 phytotoxin의 일종 으로 감자생산에 심각한 피해를 주는 물질이며 현재까지 밝혀진 10종의 thaxtomin 중 thaxtomin A가 주요한 병원성 요인물질로 밝혀져 있다 [1,2]. 이러한 질병을 구제하기 위해 여러 연구들이 시도되고 있으나 thaxtomin생합성 제어 에 필수적인 분자생물학적인 연구가 방선균의 외부 유전자 에 대한 강력한 제한계, 효율적인 형질전환 시스템의 부재, 재조합체의 불안전성 등으로 인해 많은 어려움을 가지고 있다 [3,4]. 지금까지 방선균의 형질전환에는 주로 protoplast법과 electroporation법 등이 사용되었다. 그러나 이들 방법들은 형질전환율이 높지 않거나 적용되는 방선균이 제한적이라 는 단점이 있다. 최근에 이러한 문제를 극복하기 위하여 Escherichia coli를 공여체로 사용하여 단일가닥 DNA를 세포내로 도입하는 접합전달법 (conjugal transfer)이 도입 되었다 [5,6,7]. 접합전달법은 E. coli 내에서 재조합 플라 스미드의 구축 및 조작이 가능하며 구축되어진 플라스미드 를 방선균으로 직접 전달할 수 있어 유전자 클로닝, 유전자 파괴, 변이유전자 회복 등에 폭 넓게 사용되고 있다. E. coli 를 이용한 접합전달이 Mazodier 등 [8]에 의해 처음으로 보고되어진 이후, 방선균에 존재하는 메틸화된 DNA의 제한 계를 극복하기 위해 DNA의 공여균주 (donor)로 메틸화가 결손된 E. coli ET12567/pUZ8002 [9,10,11]을 사용함으로 써 보다 다양한 속 (genus)의 방선균에 적용할 수 있게 되었 다 [12,13]. 또한 현재 사용되고 있는 접합전달을 위한 벡터들 가운데 방선균의 염색체에 존재하는 attB site로 integration 되는 phiC31유래의 attachment site (attP)와 integrase (int) 기 능을 가진 벡터들이 가장 유용한 것으로 알려져 있다 [5,11]. 이러한 벡터들은 접합전달을 통해 E. coli로부터 방선균으로 전달되고 전달된 벡터의 attP site는 integrase에 의해 방선균 염색체의 attB site로 삽입되게 된다. 그러나 감자 등의 농 작물에 심각한 피해를 주는 thaxtomin생산 방선균에 대한 형질전환방법은 아직 연구된 바 없다. 그러므로 본 연구에서는 thaxtomin을 생산하는 대표적 인 방선균인 S. scabiei의 분자생물학적인 연구를 위해 처 음으로 접합전달법을 이용한 고효율 형질전환법을 구축하 였으며 attP site 삽입 위치인 S. scabiei의 attB site에 대한 특성을 분석하였다.

Streptomyces scabiei producing phytotoxin called thaxtomin, which cause scab disease on economically important crops such as potato. For molecular genetics study of S. scabiei an effective transformation method was established based on conjugal transfer from Escherichia coli ET12567 (pUZ8002) using a phiC31-derived integration vector, pSET152, containing oriT and attP fragments. The high frequency was obtained on MS medium containing 50 mM MgCl2. In addition, the sequence and location of the chromosomal integration attB site of S. scabiei was identified for the first time in the strains producing thaxtomin by the southern blot analysis of exconjugants and the sequencing of plasmid containing DNA flanking the insertion sites from exconjugant chromosome. Similar to the case of Streptomyces species, a single phiC31 attB site of S. scabiei is present within an ORF encoding a pirin-homolog.

비듬은 비듬사상균이 원인이 되는 피부병으로 두피가 건 조해지면서 각질이 일어나 가렴움증을 수반하기도 하며 [1,2], 특히 모발에 기름이 많고 두피에 피지 분비량이 많은 지루성 비듬은 모발에 먼지가 잘 흡착되어 발생하는 것으 로 확실한 원인은 밝혀지지 않고 있다. 두피에는 한선과 피지선이 널리 분포되어 미생물이 번식 하기 좋은 환경으로 미생물이 상주하고 있다. 주요 상주 미생 물 (resident microflora)은 3개 군으로 협기성균, 호기성구균 과 진균인 Malassezia가 있다 [3]. 비듬은 이러한 정상적인 세균중 하나인 Malassezia가 남성 호르몬이 분비되는 사춘 기 이후에 두피와 같은 지루부위에서 상존하기 시작하면서 생기게 된다. 정상적인 경우 Malassezia는 지루부위에 상존 하여 정상균총의 46% 정도를 차지하게 된다. 그러나 기후, 땀, 음식 등의 환경적인 요인과 스트레스 등의 생리적인 요 인에 의해서 Malassezia가 과다하게 증식하게 되면서 정상 균총의 74%가 넘을 경우 비듬이 생기기 시작하고 83% 이상 높아질 경우 지루성 피부염으로 발병하게 된다 [4]. 1874년 프랑스에서 처음으로 비듬의 원인이 비듬균일 것 이라는 학설이 제기되었다 [5]. 그 후 1984년 비듬균으로 Pityrosporum ovale가 명시되었으나 [2], 1986년 Pityrosporum ovale라는 명칭은 동인한 효모균에서 비롯된 균사상 진균 Malassezia furfur의 명명시기가 앞서는 이유로 그 속에 통 한되어 M. furfur가 적합한 균명으로 인정되었다. 최근에는 M. furfur로부터 M. sympodialis, M. globosa, M. obtuse, M. restricta 그리고 M. slooffiae 등 5개 균종으로 분리 분류 되어 M. furfur가 차지하는 범위가 축소되었다 [6]. 비듬 치료에 사용되는 약이나 세제에는 zincpyrithione [7], piroctoenolamine, ketoconazole, sulfru, tar, seleniumsulfide 등과 같은 화학물질이 항균제로 함유되어 있다 [4]. 이들 항 진균제는 모두 정균작용에 따라 항진균 효과를 나타내기 때문에 장기적인 투여를 요하게 되어 간장 및 신장독성유 발, 두통 및 피부과민 반응 등의 부작용이 나타나고 치료가 끝난 후에도 재발되기 쉬운 문제점을 갖고 있다 [8]. 이러한 화학물질은 적은 양으로도 우수한 항균력을 가지고 있어 현재 그 사용이 보편화되고 있다. 그러나 이들 화학물질은 안전 성에 대한 우려가 있어 사용이 제한되거나 일부 국한되어 있으며 [9], 이러한 물질이 지속적으로 축척될 경우 만성 독 성, 발암성, 돌연변이 유발 등 그에 따른 부작용이 발생될 수 있는 것으로 알려져 있다 [10]. 은행잎의 항균 성분에 대한 연구는 주로 외국에서 기 초적인 연구로 진행되어 왔다[11-13]. 은행잎에 함유된 물질은 수십 종이 알려져 있으며 테르펜류인 ginkgolide, bilobalide 등이 신경계 질병을 치료하는데 일부 이용되고 있으며, flavoneglycoside인 zincomine이 혈액청정제로 상 품화되었다 [14-16]. 유럽지역에서는 현재 은행잎 엑기스 제제 (정제, 액제, 좌제, 주사제 등)의 단미제 및 복합제로 사용되고 있으며, 이에 대한 화학적, 약리학적, 임상학적인 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다 [17-21]. 본 연구에서는 은행잎 추출물이 항균효과가 확인된 바 [21], 항진균 작용이 있음을 확인하고 향후 항균 및 항진균 작용 을 갖는 세제 첨가물로 제공하고자 한다. 균주로서 대표적 인 비듬유발균인 Pityrosporum ovale을 선택하여 은행잎 추출방법과 추출물의 농도에 따른 영향을 항균작용이 있는 ginkgolide 및 bilobalide를 중심으로 항진균 효과를 검증 하고자 한다.

Antifungal effect of Ginkgo biloba leaves extracts conducted for Pityrosporum ovale. Antifungal effect verified by diffusion test, optical density test and colony counting test under various concentration. Extract of ginkgo biloba leaves performed with 40% ethanol and 60% water solution at 60℃ and major components analyzed by HPLC. The concentrated extract have bilobalide and ginkgolide A and ginkgolide B and their concentration were 153.0 mg/L, 8403.5 mg/L and 2723.0 mg/L respectively. Ginkgo biloba leaves extracts gave 99.1% of antifungal effect for Pityrosporum ovale examined by colony counting method.

그동안 다양한 바이오매스로 부터의 바이오에탄올 생산 연구가 시도 되어왔고, 바이오에탄올 생산을 위한 다양한 운전방법도 효율성과 경제성 측면에서 연구되어왔다 [1,2]. 다양한 운전방법에는 세포의 특성을 고려한 유가식 운전 [3,4], 반복 유가식 운전 [5,6], 세포 재회수 방법 [7,8], 세 포고정화법 [9,10] 등이 그 대표적인 예이다. 그 중에서 응 집성 효모를 이용한 운전방법은 효모 균체 손실 없이 다양 한 연속식 운전법이 가능하기 때문에 생산성 향상 측면에 서 연구의 대상이 되어왔다 [11-14]. 한편 바이오에탄올 생 산에서 고농도의 에탄올을 빠른 시간 내에 생산하는 것이 증류 비용을 낮추며, 공정의 운전비용을 낮추는 방법임이 보고되었고 [15], 그러한 이유로 본 연구팀을 포함한 몇몇 보고에서 에탄올 농도를 고농도로 높이기 위한 연구가 시 도 되어왔다 [16-21]. 본 연구에서는 응집성 효모인 Saccharomyces cerevisiea (S. cerevisiea) ATCC 96581를 이용하여 jar fermentor에서 반복 유가식 에탄올을 생산할 때 가장 효율적이고 경제성 있는 운전전략에 대하여 연구하였다. S. crevisiea ATCC 96581는 펄프산업의 페기물인 spent sulfite liquor에서 발견 한 효모로서 바이오매스 가수분해물에 존재하는 제해물질에 대하여 내성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다 [20-23]. 본 연구팀은 선행 연구에서 고농도의 에탄올을 생산할 때 미량의 공기 첨가효과에 대하여 조사하였고, 이를 이용한 반 복 유가식 운전법에 대한 선행연구를 실시하였다 [19,23,24]. 그리고 또 다른 효모인 S. cerevisiea ATCC 24858을 이용 한 반복 유가식 운전전략에 대하여서도 선행연구를 실시하 였다 [25]. 본 연구에서는 이러한 선행연구 결과와 응집성 효모인 S. cerevisiea ATCC 96581을 이용한 연구 결과에 대하여서도 비교분석 하려고 한다.

We investigated the optimal strategy for ethanol production using flocculent Sacchromyces cerevisiae ATCC 96581. Considering the characteristic of flocculent yeast, a repeated fed-batch ethanol fermentation was designed, in which non-sterile glucose powder was fed every 12 hours and, after cell flocculation, new feeding medium was exchanged every 24 or 36 hours. We particularly compared this fermentation process with those when cell flocculation was not carried out. Finally, the maximal total ethanol production was 825 g-ethanol during 120 hours, in which the time interval of withdrawal-fill of feeding medium was 24 hours and cell flocculation was carried out.

Renewable energy 자원으로서 bioethanol에 대한 관심으 로 보다 경제적으로 ethanol을 생산하려는 연구와 이에 대 한 선행기술 평가가 구체적인 실례와 함께 진행되어져 왔 다 [1-4]. 특히 에탄올 발효에서의 에탄올 생산성 증가를 위 하여서는 최종 발효액에서의 ethanol 농도의 증가를 통한 distillation cost의 절감 등이 고려되었으며 [5], 이때 고농 도의 ethanol 조건에서의 ethanol 발효의 계속적인 진행을 어떻게 하면 효율적으로 할 것인가에 대한 운전전략이 productivity 측면에서 고려되기도 하였다 [6]. 그동안 많은 연구자들에 의하여 여러 가지 인자 중에서 ethanol inhibition 을 감소시키고, by-product인 glycerol의 생성을 줄이기 위한 방법으로 미량으로 조절된 공기를 첨가하여 ethanol 발효 를 진행하는 방법이 연구되어왔다 [7-15]. Ethanol 발효 시 aeration은 ethanol inhibition으로 부터 효모의 viability를 증가 시키고 [7-9], 세포막의 파괴를 방지 해주는 역할을 하는 것으로 알려져 왔다 [16-20]. 본 연구팀도 ethanol 내성 을 가지고 있는 Saccharomyces cerevisiae를 사용한 선행연 구에서 공정 조절이 가능한 범위의 aeration 조건에서 공기의 주입이 ethanol inhibition을 감소시키고, ethanol 발효에서 ethanol 생산을 증가시킴을 확인하였다 [6,21,22]. 이때 최고 의 ethanol 생산을 보이는 최적의 aeration rate을 실험적으로 정하였고, 반복 유가식 발효를 통하여 조절된 공기의 주입이 ethanol 생산에 효과가 있음을 보여주었다 [22]. 본 연구에서는 ethanol 발효 효모인 S. scerevisiae ATCC 24858 를 사용하여 ethanol 생산성이 최대가 되는 최적의 aeration rate을 확인하는 연구를 수행하였으며, 특징적으로 최적의 aeration 조건에서 glucose와 배지를 어떠한 전략으로 withdrawal-fill 해야 ethanol의 생산이 최대로 증가할 수 있는지에 대하여 연구하였다. 이러한 연구를 통하여 반복 유가식 ethanol 발효에서 최고의 ethanol 생산을 위하여서 는 운전 전략의 설계와 실증이 매우 중요함을 보여 주었고, 다른 발효생산물 반복 유가식 발효 방법으로 생산 할 때도 응용 되어 질 수 있을 것으로 생각 된다.

We designed the optimal operational strategy in repeated fed-batch ethanol fermentation using Sacchromyces cerevisiae ATCC 24858 in views of ethanol yield, specific ethanol production rate, and ethanol productivity, when the aeration rate were controlled at 0.0 and 0.33 vvm. Coincidentally, the time intervals of withdrawal-fill of culture medium (24 and 36 h) were investigated. Ethanol yield and ethanol productivity when the aeration was carried out at 0.33 vvm were superior to those when the aeration was not carried out. Additionally, those parameters when the time interval of withdrawal-fill of culture medium was 24 h were superior to those when time interval of withdrawal-fill of culture medium was 36 h. The total ethanol production reached at the greatest value, 703.8 g-ethanol, when the aeration was carried out at 0.33 vvm and the time interval of withdrawal-fill of culture medium was 24 h. In this study, we verified experimentally the necessity of designing the operational strategy for increasing ethanol production in terms of aeration rate and time interval of withdrawal-fill of culture medium in the repeated fed-batch ethanol fermentation.

Taxus wallichiana Zucc.는 일명 히말라야 주목으로 불리 고 있으며, 주로 파키스탄과 인도에 분포 서식하고 있다 [1]. 이 주목은 그 지역에서 전통요법 치료제로 다양하게 활용 되고 있는데, 특히 잎은 asthma, indigestion, epilepsy 등에 효과가 있다고 전해지고 있다 [2]. 일반적으로 주목은 항암 제 paclitaxel 또는 그 유도체들을 생합성하는 사실이 널리 알려져 있으며, T. wallichiana도 paclitaxel 뿐 아니라 새로 운 유도체들이 발견되어 보고되고 있다 [3,4]. Paclitaxel은 유방암과 난소암을 포함한 여러 가지 종류 의 암에 대해 탁월한 치료 효과를 보여 널리 사용되고 있는 항암물질이다. 암세포에 대한 paclitaxel의 작용기작은 기존 대부분의 항암제들이 tubulin으로부터 microtubule의 형성 을 방해하는 것과는 달리 cell cycle 상의 G2 후반기 또는 M phase에 작용하여 microtubule의 합성을 촉진하고 안정 화시켜 그 후의 분해 과정을 억제하는 특이한 기작을 갖는 다 [5]. 미국에서는 1983년에 FDA에 의해 임상실험이 시 작되어, 10년 후인 1992년에 난소암 치료제가 허가를 받아 Bristol-Myers Squibb사에 의한 판매가 허용되었으며 1994년 에는 유방암의 치료에도 사용이 허가되었다. Paclitaxel의 생산 공급은 주로 주목 나무로부터 추출에 의존하여 왔으 나, 환경파괴의 문제 등으로 다양한 대체방법이 개발되었다. Paclitaxel의 전합성 뿐 아니라 전구체를 이용하는 반합성 법, 그리고 주목 식물세포 배양을 통한 생산 방법 등이 개 발되었다. 이러한 여러 방법 중에서도 가장 친 환경적이며 경제성이 우수한 방법으로 주목세포배양에 의한 paclitaxel 생산 방법이 인정되고 있으며, 이미 여러 국가에서 생산 중 이거나 시도하고 있는 것으로 알려져 있다. 식물 또는 식물세포배양에서 이차대사산물의 생성을 촉진 하는 물질을 elicitor라고 하며 elicitor 처리에 의하여 축적 되는 이차대사산물의 antibiotic 활성을 지닌 화합물을 일반 적으로 phytoalexin이라 한다. Phytoalexin의 축적에 의한 antibiotic 방어는 식물의 방어기작의 하나로 매우 중요한 역할을 한다. 다양한 종류의 물질이 elicitor로서 작용할 수 있는데, elicitor는 크게 두 종류로 구분된다. 균류, 세균, 효모 등의 추출물로부터 또는 여과액 등과 같이 생물체로부 터 얻어지는 화합물을 biotic elicitor라하고 chemical stress agent와 biotic elicitor 이외의 모든 물질들을 abiotic elicitor 라 구분한다. Elicitor의 다양한 종류와 관련 작용 기작은 크 게 네가지로 구분된다. 첫째 미생물에 의한 elicitor의 직접적 방출에 의하여 식물세포가 인식하는 과정으로 대두세포의 경우 elicitor receptor site가 원형질막에 위치하고 있음을 보여준다. 둘째로 미생물 유래의 효소로부터 식물세포벽의 구성성분이 분해되어 elicitor로 작용하는 방법으로 대표적으 로 균류의 endopolygalacturonic acid lyase와 pectinase를 들 수 있다. 셋째로 식물세포의 효소에 의해 미생물 세포벽 성분이 방출되어 elicitor로 작용하는 과정으로 여기에 속 하는 예로 chitosan과 β-1,3-endoglucanase를 들 수 있다. 넷째로 여러 종류의 자극에 대하여 식물세포에 의하여 형 성 또는 방출되는 elicitor로서 자연계에 endogeneous하고 constitutive한 특성을 지닌다 [6,7]. Elicitor의 사용은 식물세포배양에서 목적하는 이차대사 산물의 생산성 향상으로 이어질 수 있어 식물세포배양에 의한 유용물질 생산의 상업화 과정에서 중요한 방법으로 적용될 수 있다. 또한 한 종류의 elicitor를 쓰는 것 보다 두 종류 또는 그 이상의 복합 elicitor를 적용하는 경우 이차대사 산물 생성 증진 효과가 우수할 수 있다. 본 연구에서는 이러 한 elicitor의 영향을 T. wallichiana 현탁배양에서 paclitaxel 생산 증진 연구를 통하여 밝히고자 한다. 특히 신호전달 물질인 jasmonic acid와 cellulase 복합 elicitor를 적용하여 paclitaxel 생성에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.

Cell cultures of Taxus wallichiana Zucc. were made to enhance the production of anticancer agent paclitaxel. In suspension cultures, the maximum cell growth rate in exponential growth phase was 0.14 day-1 which was correlated to 4.96 days of cell doubling time. The production of paclitaxel was non-growth associated. The paclitaxel production was started after the exponential growth phase and increased to declined phase where the maximum concentration was observed. Various elicitors were tested to enhance the production of paclitaxel. The combination of two elicitors of jasmonic acid and cellulase increased the production of paclitaxel 1.8 and 3.1 times compared to paclitaxel production by individual elicitor respectively.

인간에게 발생되는 여러 질병들 중 많은 부분이 유전자 변형에 기인된 것이고, 이러한 유전자 변형을 빠르고 정확 하게 분석하는 일은 질병의 조기 진단 측면에서 매우 중요 한 일이라 할 수 있다. 인간의 DNA를 분석하는 방법으로는 여러 가지가 있지만, 그 중 모세관 전기영동 장치 (capillary electrophoresis, CE)를 이용하여 염기 서열의 이상 유무를 판별하는 것이 현재 널리 쓰이는 방법 중 하나이다 [1]. CE를 이용하여 DNA를 분석하기 위해서는 먼저 모세관 내부에 점도가 높은 고분자 젤을 충진시킨 후 DNA 샘플을 분석하는데, 이는 일반적으로 DNA의 크기에 따른 분리가 수용액 상에서 불가능하기 때문이다 [2]. 그러나 현재의 이 와 같은 분석 방법은 직경이 좁은 모세관 내부에 고점도의 고분자 젤을 충진시켜야 되는 어려움 때문에 분석 장치를 소형화하는 데에 있어 어려움이 따르며, 특히 길이가 짧은 oligonucleotide의 분리의 경우 분석 한계를 나타내고 있다 [3]. 이러한 문제를 해결하기 위해 DNA 끝에 마찰력을 부여할 수 있는 물질을 연결시킨 후, 수용액 상에서 DNA의 크기에 따른 분리가 가능한 방법이 제안되었다 [4]. 이러한 방법을 End-Labeled Free-Solution Electrophoresis (ELFSE), 또는 Free-Solution Capillary Electrophoresis (FSCE)라 하며 이 때 마찰력을 부여하는 물질을 drag-tag이라 명하였다 [5,6]. Drag-tag으로 사용될 수 있는 물질은 여러 가지가 있지만 효과적인 DNA 분석을 위해서는 수용성 (water solubility), 전기적 중성 (charge neutrality), 균일성 (size monodispersity) 등의 조건을 만족시키는 물질이어야 하며, 반복단위 단백 질은 이러한 조건들을 만족시킬 수 있는 우수한 후보물질로 제안되었다 [7-9]. 일반적으로 생합성을 통해 생산된 자연 계에 존재하는 단백질은 균일한 크기를 갖는다는 장점을 가지고 있으나, 수용성 단백질 대부분은 양전하 또는 음전 하의 전하를 갖는다는 문제점이 있다. 또한 화학적으로 합 성된 고분자 물질의 경우 단량체를 변환시킴으로써 수용성 및 전기적 성질을 조절하는 것이 가능하나 균일한 크기의 고분자 물질을 얻기가 어렵다는 한계가 있다. 하지만 반복 단위 단백질의 경우, 유전자 재조합을 통해 원하는 물성을 갖는 아미노산만으로 구성이 가능하며 DNA 조작에 의하여 반복단위를 늘림으로써 다양한 크기의 단백질을 합성하는 것이 가능하다. 이러한 장점을 바탕으로 수용성이며 전기적 으로 중성인 아미노산들로 이루어진 반복단위 단백질을 합성 함으로써 이상적인 drag-tag에 가까운 물질을 만들 수 있었다. DNA 염기 분석을 하는 방법으로는 크게 DNA polymerase 를 이용하는 방법과 DNA ligase를 이용하는 방법, hybridization 을 이용한 방법 등으로 나뉠 수 있다 [10]. DNA polymerase 를 이용하는 방법 중 single-base extension (SBE) 기술은 ddNTP만을 이용해 DNA primer의 3’ 말단에 오직 하나의 염기만이 덧붙여져 유전자의 이상 유무를 판별하는 방법으 로써 SNP (single nucleotide polymorphism) 등을 밝혀내고 각각의 영향을 규명하는데 효과적으로 사용될 수 있다 [11]. SNP란 유전체 내에서 개개인의 편차를 나타내는 한 개 또는 수십 개의 염기 변이를 말하는 것으로써, 인간의 경우 30억 개의 염기 서열 중 약 0.1% 정도가 개인마다 차이를 보이고 있으며, 이러한 차이가 인종, 피부색, 체질, 질병 등의 유전적 특징을 나타낸다고 알려져 있다. CE를 이용한 DNA 분석은 상대적으로 비싼 운전비용과 복잡하고 비싼 장비를 필요로 하기 때문에 현재는 이러한 CE의 단점을 극복할 수 있으며 소형화, 집적화가 가능한 microchip 상에서의 모세관 전기영동이 활발히 연구되고 있다 [12]. Microchip 시스템의 경우 기존의 CE보다 더 적 은 양의 샘플로 보다 빠른 DNA 분석이 가능하다는 장점 을 가지고 있으나, 장비가 소형화됨에 따라 좁은 모세관 내부를 고점도의 고분자 젤로 충진시켜야 하는 어려움이 발생된다. 또한 SBE 반응 후 전기영동에 의한 분석의 효율 성을 증대시키기 위해서는 모세관 하나 당 여러 개의 샘플을 동시에 분석할 수 있는 다중 시스템 (multiplexed system) 의 개발이 필요하나 현재의 고분자 젤을 이용한 분석 방법 으로는 길이가 같은 SBE의 생성물들의 분리가 불가능하 다는 한계가 있어 보다 효율적인 분석 시스템을 구현하는데 어려움이 있었다. 따라서 수용액 상에서 DNA 분리를 수 행하는 ELFSE 방법은 이러한 문제점들을 해결할 수 있는 좋은 대안으로 떠오르고 있다. 최근에는 SBE와 ELFSE를 복합적으로 이용하여 DNA 염 기 분석을 시도한 SBE-ELFSE 연구가 보고되었다 [11,13]. 다양한 크기의 drag-tag을 DNA primer에 화학적으로 결 합시킨 후, 결합된 생성물들을 이용하여 SBE 반응을 수행 함으로써 동시에 여러 위치의 염기 분석이 가능하였다. 하 지만 사용된 drag-tag 대부분이 화학적으로 합성한 것이기 때문에 그 합성 길이에 제한이 있어 그에 따른 분석 효율에 도 한계가 있었다. 따라서 본 연구에서는 대장균을 이용하여 반복단위 단 백질을 합성함으로써 보다 큰 크기를 갖는 drag-tag을 생산 하였고 이를 DNA와 연결한 후, 모세관 전기영동을 수행 하였다. 모세관 내부가 수용액으로 충진된 microchip 상에서 서로 다른 크기를 갖는 반복단위 단백질 drag-tag에 동일 한 DNA를 연결시킨 후 전기영동을 통하여 그 이동 속도 의 차이를 살펴봄으로써 효율적인 SBE-ELFSE 시스템의 구현을 위한 기초 실험을 수행하였다.

We generated the feasibility of DNA separation in free-solution using genetically engineered repetitive polypeptides as drag-tags. Two different-sized repetitive polypeptides were designed, expressed in E. coli, and purified. They were conjugated to a fluorescently labeled DNA (100 base), and the electrophoretic mobilities of these conjugate molecules were analyzed on a microchip. The results of these studies indicate that genetically engineered repetitive polypeptide is a prominent candidate for rapid and high-throughput genetic mutation detection, such as SNP analysis.