Earticle

Lentinus edodes의 액체배양을 통하여 균사체 및 polysaccharide의 최적 생산조건을 조사하였다. 플라스크 배양을 통하여 검토된 균체량 및 polysaccharede 생성을 위한 최적 배지의 조성은 glucose 60 g/L, yeast extract 10 g/L, KH2PO4 2.0 g/L, MgSO4․7H2O 1.0 g/L이었다. 최대 균체량은 배양 10일째 11.01 g/L이었으며 최대 polysaccharide 생성량은 배양 6일째 1.64 g/L를 나타내었다. 생물반응기를 이용한 회분배양에서 균사체와 polysaccharide 생산량을 증가시키기 위하여 통기량을 조절하였다. 그 결과 통기량이 증가할수록 균체량과 polysaccharide의 생성량이 증가하였다. 결과적으로 통기량을 1.5 vvm으로 하여 배양하였을 때 배양 8일째 55.9 g/L의 균체량과 배양 7일째 7.34 g/L의polysaccharide로 최대생성량을 얻을 수 있었다.

The optimum liquid culture conditions were investigated for cell growth and polysaccharide production from liquid culture of Lentinus edodes. In flask culture, the optimal medium compositions for the polysaccharide production contained glucose 60 g/L, yeast extract 10 g/L, KH2PO4 2.0 g/L, and MgSO4․7H2O 1.0 g/L. The maximum mycelial growth and polysaccharide production were 11.01 g/L and 1.64 g/L, respectively. In bioreactor, through the variation of aeration in order to increase mycelial growth and polysaccharide production, the maximum mycelial growth and polysaccharide production were 55.9 g/L at 8th day and 7.34 g/L at 7th day of cultivation with 1.5 vvm, respectively.

진균류 추출물로부터 신규 멜라닌 분해효소의 분리 및 분해능 test는 멜라닌 분해효소의 균사체 배양 상등액으로 분비 생산됨을 분해능 테스트를 통하여 확인하였고, 이 분해 효소에 의한 멜라닌 분해반응은 pH 7에서 가장 높고, 30℃에서 가장 안정함을 확인하였다. 멜라닌 분해 효소의 characterization은 2D-gel을 이용하여 멜라닌 분해효소 중 한 가지 효소의 pI값이 약 6.5이고 Molecular weight는 약 54-57 kDa임을 알 수 있었고, 정제된 멜라닌 분해 효소의 전체적인 단백질 및 유전자 서열을 분석하여 degenerate primer를 합성하였으며, RT-PCR 법을 이용하여 유전자를 확보하였다. 멜라닌 분해효소 생산을 위한 진균류의 배양 방법 확립은 멜라닌 분해효소가 최대 활성을 갖는 배지 조건은 ammonium tartrate 0.4% : glucose 2% 배지에 yeast extract를 0.1%를 첨가한 배지임을 확인하였고, 진균류의 최적 배양온도는 24-26℃였으며, 이 때 건조 균체 중량으로 약 6 g/L의 균체를 얻을 수 있었다. 또한 진균류 성장의 최적 pH는 약 5.5로서 이 경우 건조균체중량이 약 6.6g/L였다. 정제공정은 최적화를 통하여 멜라닌 분해효소의 정제 순도 90% 이상의 정제공정을 확립하였다. Scale-up은 5 L fermenter를 이용한 기초 배양공정을 확립하여 500 L fermenter로의 경제성 있는 scale up에 성공하였고, 이 때 건조균체중량 약 14.5 g/L의 진균류를 얻었으며, 배지 중에 분비 생산된 melanin 분해효소의 양이 300 mg/L에 달하였다. 멜라닌 분해효소의 formulation은 멜라닌 분해효소를 효율적으로 피부로 전달시키기 위하여 50-100 nm 크기로 encapsulation을 실시하여 70 nm, 100 nm size의 nano capsule을 얻었다. 본 연구는 tyrosinase 저해제가 갖는 부작용이 없어 생체 친화적 물질에 의한 부작용 감소 효과가 기대되며, 독자적 기술에 의한 고부가 미백용 화장품 원료 확보로 새로운 기능에 의한 신규시장 창출이 가능하여 미백용 기능성 화장품 원료로서 고부가 화장품에 사용되어 수입대체효과 및 기업의 매출증대 효과가 있을 것으로 기대되어진다.

Extensive research was carried out for inhibition of melanin formation as development of whitening cosmetic ingredients. But degradation of melanin itself was not intensively pursued as development of cosmetics. In this study, novel melanin degradation enzyme was developed and characterized. Also this enzyme production process was optimized and formulation was tried using micro encapsulation technique.

Cellobiohydrolase (CBH) I 유전자의 확보는 CBH I 유전자 cellulase 생산 균주인 Trichoderma reesei를 배양, 수거하고 액체 질소를 이용하여 세포를 파쇄 후 RT-PCR kit를 이용하여 CBH I gene을 합성하였다. 그 후 발현벡터인 pYGAL에 cloning하였다. CBH I 유전자 앞부분에는 CBH I 단백질이 cell 외부로 분비할 수 있도록 하는 ppL이 포함되었다. CBHI 단백질 발현은 Protein gel 결과를 통하여 발현을 확인하였다. Cellulase 활성을 증대시키기 위한 분자진화 방법 개발은 error prone PCR과 DNA shuffling을 수행하였다. 얻은 CBH I 유전자를 발현 벡터에 삽입하고 효모에 transformation하여 이것을 다시 screening하였다. 1차 screening 후 confirm test하기 위해 DNS (Dinitrosalicylic Acid) 환원당 측정법을 이용하였으며, 이 결과 121-D8, 228-G2, 389-E3, 412-B4, 456-D2의 cellulase 변이체를 획득할 수 있으며, 456-D2의 경우 original CBH I과 비교하여 약 510%의 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 분자 진화 된 cellulase sequence 분석결과 CBH I wild type과 비교하였을 때 121-D8의 경우 변경된 9개의 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 6개, 228-G2의 경우 변경된 7개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 4개, 389-E3의 경우 변경된 13개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 9개, 412-B4의 경우 변경된 9개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 6개, 456-D2의 경우 변경된 10개의 바뀐 염기 중 아 미노산의 변화에 영향을 준 염기는 7개이었다. Cellulase 생산 공정 최적화는 5 L 발효기를 이용하여 고 농도 배양을 실험한 결과 최종 O.D. 120까지 진행할 수 있었으며, 약 1.2 g/L의 cellulase를 얻을 수 있었다. Cellulase 생산 공정 scale-up 5 L 규모에서 확립된 최적 fed-batch 발효 공정을 300 L로 scale-up하여 실험하였다. 최종 O.D.는 약 280 정도이며 cellulase의 발현양은 약 3.2 g/L 수준임을 확인하였다. Cellulase 정제 공정 최적화 결과 80%의 수율과 95%의 순도를 확보하였다.

Although Energy demands of modern society increase rapidly, curent energy would be exhausted shortly. Therefore development of bio-ethanol production process from cellulose containing materials was extrmly demanded. Therefore development of highly functional cellulase is requisite for this purpose. In this study cellobio-hydrolase (CBH1) gene from Trichorderma reesei was used to increase cellulase activity by directed evolution and highly functional cellobio-hydrolase was obtained and characterized.

H. erinaceum은 현재 산업적으로 매우 주목되고 있는 기능성 소재들 중의 하나이다. 본 연구에서는 식용은 물론 각종 약리효과를 나타내는 H. erinaceum의 기능성 식품의 제품화 연구 일환으로, 지금까지 체계적으로 연구된 바 없는 H. erinaceum의 액체배양을 시도하고. 생성된 균사체의 생리 기능성의 변화를 자실체의 물 추출물과 비교, 조사함으로써 H. erinaceum 액체배양 생성물의 생리기능 효과를 평가, 규명하고자 하였다. H. erinaceum의 자실체 및 균사체 물 추출물은 HeLa (human cervix pitheloid carcinoma; 인간 자궁 상 피암세포), Raw264.7 (mouse monocyte macrophage; 생쥐 단핵 대식세포), Jurkat (human acute T cell leukemia, 인간 급성 T 백혈병 세포), KATO3 (human gastric carcinoma 인간위장 암세포), EL4 (mouse T lymphoma 생쥐 T 림프종 세포), LyD9 (mouse bone marrow plurypotent stem cell; 생쥐공수유래 간세포) 등 각종 암세포주에 대해 농도 의존적으로 증식 억제 효과를 나타내었다. 자실체 추출물은 균사체추출물보다 대부분의 암세포 증식의 억제 효과가 컸으며, 가장 높은 암세포 증식 억제효과를 보인 자실체 열수 추출물의 효과는 Raw 264.7 및 EL4 세포주를 사용한 Taxol와의 비교실험 결과, 자실체 농도 0.01～10 mg/ml에서 자실체 사용량의 1/1000에 상당하는 양의 Taxol 효과와 비슷하였다. 자실체 및 균사체 열수 추출물들은 1 mg/ml 농도에서 복강 세포의 nitric oxide 생산 유도능을 나타내었으며, lipopolysaccharides 자극으로 더욱 증가하였다. 반면, 비장세포의 증식유도능 및 interleukin-2 유도능에서는 각 시료 단독으로는 증식 유도 및 interleukin-2 유도능을 나타내지 않았으나 각각 lipopolysaccharide와 concanavalin A의 첨가 및 concanavalin A 자극으로 강한 증식유도능 및 interleukin-2 생산능을 나타내었고, 그 효과는 균사체 추출물에서 자실체 보다 더욱 높았다. 또 각 시료는 골수세포에 대해서도 약간의 증식효과를 보였으며, 복강세포의 탐식능을 나타내었다.

The water-soluble materials extracted from fruit bodies and mycelium of H. erinaceum were prepared. In-vitro anticancer activities on cancer cells and In-vivo proliferation effect on mouse peritoneal exudate cell and spleen cell of samples were investigated. Also, nitric oxide (NO) generation of peritoneal exudate cell, IL-2 production capacity of spleen cells and phagocytic activity of peritoneal macrophages were examined. The water extracts of H. erinaceum suppressed the proliferation of cancer cell (HeLa, Raw264.7, Jurkat, KATO3, EL4, LyD9) with concentration-dependent. The water extract from fruit body showed better suppression effect than that from mycelium in most of cancer cells used. The anticancer effect of water extract of fruits body in the range of 0.01 and 10 mg/ml for Raw 264.7 and EL4 cell lines were the same as the Taxol with one thousandth equivalent of fruit body concentration. Water extracts of fruit body and liquid-cultured products of H. erinaceum induced nitric oxide (NO) generation of peritoneal exudate cell and increased NO generation by stimulus of lipopolysaccharide. Water extracts alone did not induce the proliferation and IL-2 production capacity of spleen cells. However, spleen's proliferation and IL-2 production were induced significantly by the addition of lipopolysaccharide and Con A (concanavalin A) or Con A alone, and the effectiveness of mycelium extract with water were more active than those from fruit body.

H. erinaceum은 현재 산업적으로 매우 주목되고 있는 기능성 소재들 중의 하나이다. 본 연구에서는 식용은 물론 각종 약리효과를 나타내는 H. erinaceum의 기능성 식품의 제품화 연구 일환으로, 지금까지 체계적으로 연구된 바 없는 H. erinaceum의 액체배양을 시도하고. 이 버섯의 액체배양 생성물의 acetylcholinestrase (AChE) 저해활성과 항산활성의 효과를 자실체와 비교하면서 평가, 규명하고자 하였다. Electrophorous electricus 유래 AChE에 대한 저해 활성을 조사한 결과, 자실체 및 배양 생성물 (균사체와 배양여액)은 10 mg/ml 농도에서 75～85%의 저해활성을 보였고, 저해기작은 모두 일반적 비경쟁적 저해 (general non-competitive inhibition)에 의하였다. 특히, 배양여액의 ethanol 침전 상징 액은 10 mg/ml의 농도에서 약 94%의 매우 높은 저해활성을 보였다. 한편, linoleic acid를 기질로 한 지질과산화에 대한 노루궁뎅이 버섯 유래 시료들 (자실체와 균사체 추출물, 균사체 추출물의 ethanol 침전물 및 배양여액)의 억제능을 Rhodan-Fe (FTC)법으로 조사한 결과, 균사체와 자실체 추출물은 0.1 mg/ml의 농도에서 지질의 초기 과산화를 완전히 억제하였다. 또 TBA-RS로 조사한 경우도 항산화 표준품으로 사용한 tocopherol, vitamin C 및 rutin보다 우수하였고, 시료들 간의 큰 차이 없이 약 95%의 매우 우수한 지질과산화 억제율을 나타내었다.

The water-soluble or ethanol-soluble materials extracted from fruit bodies and cultured products (mycelium and broth) of H. erinaceum were prepared, and their inhibitory effect on acetylcholinesterase (AChE) activity from Electrophorous electricus was investigated. Inhibition of 75-85% for AChE activity at concentration of 10 mg/ml was obtained and the mechanism was due to general non-competitive inhibition. Especially, the supernatant of culture broth by ethanol treatment, exhibited a strong inhibition activity of 94% at 10 mg/ml. The samples from fruit body, mycelium and broth (supernatant and precipitate by ethanol treatment) which were extracted from H. erinaceum, were very effective to inhibit the initial stage oxidation of a linoleic acid at concentration of 0.1 mg/ml. The antioxidative activity of these samples were superior than rutin, vitamin C and tocopherol as antioxidative standards by FTC (ferric thiocyanate) method, and also showed the very strong antioxidative activity of 95% without significant difference of the samples by TBA-RS (thiobarbituric acid-reactive substance) method.

본 연구에서는 배양시간에 따른 Thraustochytrium aureum ATCC 34304 균체 내부에 저장하는 지질의 지방산조성 및 균체 막에 축척하는 지질 내의 지방산조성의 변화 과정을 정량적으로 규명하였다. 건조균체량은 배양 5일째에 3.94g/L를 나타내었으며, 균체당의 지질 함량은 배양 3일째에 최대값 25.0%를 나타내었다. 균체 내의 triacylglyceride (TAG)량은 배양 3일까지는 증가하였으나 그 이후에는 거의 일정한 값을 유지하였다. 반면 세포막을 구성하는 phospholipid (PL)의 함량은 3일까지는 감소하나 그 이후에는 일정한 값을 나타내었다. TAG를 구성하고 있는 다중불 포화지방산의 함량은 배양 초기 60.3%이였으나 배양 5일 후에는 45.3%까지 감소하였으며, DHA는 42.1%에서 33.9% 까지 감소하였다. 포화지방산의 함량은 배양 초기에는 24.9%이었으나 배양 5일 후에는 27.8%까지 증가하였다. PL 내의 불포화지방산의 함량은 배양시간에 따라 48.0%에서 17.5%까지 크게 감소하는 경향을 나타내었으나, 포화지 방산의 함량은 오차범위 내에서의 감소 경향을 나타내었다. 본 연구 결과에 의하면 배양시간이 경과하여 배양액내의 영양 환경이 열악하게 되는 경우 균주는 포화지방산보다 불포화지방산을 에너지원으로 우선 사용한다고 해석할 수 있다.

The heterotrophic marine algae Thraustochytrium aureum ATCC 34304 produces substantial amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs), especially docosahexaenoic acid (DHA). In this study, changes in the lipid and fatty acid compositions of Thraustochytrium aureum ATCC 34304 were investigated according to the growth stage. The major lipids of Thraustochytrium aureum ATCC 34304 were found to be composed of triacylglyceride (TAG), phospholipid (PL), and sterol (ST). The content of triacylglyceride increased during the exponential phase of cell growth, but the content of phospholipid decreased. The composition of total polyunsaturated fatty acids decreased from 60.3% to 45.3% and that of docosahexaenoic acid from 42.1% to 33.9% in the triacylglyceride. The composition of total saturated fatty acids, however, increased from 24.9% to 27.8%. The content of total polyunsaturated fatty acids decreased greatly from 48.0% to 17.5% but the decrease in the content of saturated fatty acids was slight in phospholipid.

신문지와 같은 폐지의 가수분해에 미치는 계면활성제의 영향을 조사하였다. 전처리 공정에 적합한 계면활성제는 사용한 9종의 비이온 계면활성제 중 NP 계열 계면활성제가 가장 좋은 전처리 효과를 나타내었다. NP-20을 사용하여 전처리 공정을 최적화한 결과 계면활성제 농도, 교반속도, 전처리 온도와 시간이 0.5%, 100 rpm, 30℃와 1시간일 때 최적조건이었다. 당화율을 최대화하기 위하여 기질을 NP-20으로 전처리하고 전처리된 기질을 TW-80을 첨가하여 가수분해하였다. 계면활성제를 사용하여 전처리된 기질 을 계면활성제를 첨가하여 가수분해하면 가수분해에서 계면활성제의 효과가 거의 없었다. 그래서 가수분해 공정에서만 계면활성제를 사용하여 효소와 계면활성제의 첨가순서에 따른 당화율을 조사하였다. 조사결과 기질에 효소를 넣고 난 후 계면활성제의 첨가시기가 늦을수록 당화율이 낮아지는 경향을 나타내었다.

The effect of surfactant on the hydrolysis of used newspaper was investigated. The most suitable surfactant for the pretreatment stage was found to be NP-series surfactants among 9 kinds of nonionic surfactants. Process parameters such as surfactant concentration, mixing speed, pretreatment temperature and time were tested to optimize for maximum digestibility and 0.5%, 100rpm, 30℃, and 1 h were found to be optimum, respectively. In order to maximize digestibility, substrate was pretreated with NP-20 and then the pretreated substrate was hydrolyzed by adding TW-80. The effect of surfactant on the hydrolysis of previously surfactant-pretreated newspaper was marginal. Therefore, the digestibility with the addition order of enzyme and surfactant was investigated by using surfactant only in hydrolysis stage. The results show that digestibility was more lowered as the surfactant addition after adding enzyme to substrate was more delayed.

본 연구에서는 sonificator를 장착하여 세포막을 파쇄하고 현장에서 형광을 이용하여 조작이 간편하고 단시간에 DNA와 단백질을 동시에 측정할 수 있는 자동화된 형광기를 개발하기 위하여 단백질을 측정하는데 최적의 파쇄조건을 확립하고자 하였다. 용액 중에 녹아 있는 공기 중의 oxygen은 collisional quenching을 일으키는데 sonification이나 가열처리를 시키면 oxygen이 제거되어 quenching 효과가 크게 감소되어 높은 형광값을 나타내었다. 0.7 X 이상의 형광시약 농도에서는 반응시작 후 1분 이내에 측정해야 하며, 0.3 X 이하의 형광 시약 농도에서는 반응시작 후 2~3분 사이에 반응을 시킨 후 측정하는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 100 ㎍/㎖ 이상의 BSA 농도에서는 형광시약이 포화되었으며, 시료를 sonification시키면 단백질이 변성되어 눈에 보일 정도로 불투명해져서 시료 용액의 불투명도로 인해 형광 값이 감소되는 경향을 나타내었으며, 1 ㎍/㎖ 이하의 BSA 시료에서는 sonification을 시키지 않은 시료보다 sonification을 시켰을 때 0.125 ㎍/㎖의 BSA를 훨씬 더 구분이 잘 되어 낮은 단백질 농도에서는 sonification시키는 것이 훨씬 유리한 것으로 나타났다.

This study was carried out to establish the optimum disruption condition of a sonificator for the protein toxin for the purpose of developing automatic biological agent detector equipped a sonificator. One of the best-known collisional quenchers is molecular oxygen, which quenches almost all known fluorophores. The sonification does an excellent job of degassing, which decreased the quenching effect and increased the fluorescence quantity. The fluorescence measurement for the protein using 0.7 X fluorescent dye concentration and above must be done in 1 minute and the fluorescence measurement for the protein using 0.3 X fluorescent dye concentration and below has to be done between 2 and 3 minute. The fluorescence quantity of the sonificatied protein sample was much higher that of the non-sonificatied protein sample. Sonificating the sample turned out to be favorable for the fluorescence measurement when measuring at the low protein concentration.

강낭콩 유식물로부터 PBS에 의한 추출, (NH4)2SO4 침전, Sepadex G-100 column chromatography에 의해 lectin을 분리 한 다음, 이들의 생화학적 특성으로서 분자량, 적혈구 응집반응, 열 안정성, 최적 온도 및 최적 pH를 연구하였다. 이 과정에 토끼 혈액의 적혈구를 이용하여 활성을 측정하였다. 이 lectin의 분자량은 46 kDa와 44 kDa로서, 각각 2개의 subunit를 갖는 tetramer이다. 정제된 이 lectin의 최적 반응 온도는 30℃이며, 40~80℃에서 열 안정성을 보였다. 또한 이 lectin의 최적 pH는 pH 8.2이다.

We have studied biochemical characterization of lectin purified from kidney bean seedling through PBS extraction, (NH4)2SO4 precipitation, and Sephadex G-100 affinity chromatography. The lectin was agglutinated by rabbit erythrocytes. This lectin analyzed by SDS-PAGE is a tetramer composed of two subunits with molecular weights of 46 and 44 kDa. The optimal temperature and thermal stability of the lectin was 30℃ and 40-80℃, respectively. The maximal pH of this lectin was pH 8.2.

본 연구에서는 은행잎에 존재하는 생리활성 물질이 추출용매와 추출조건에 따른 D. pteronyssinus에 대한 살충 실험을 통해 최적 추출 조건을 확립하였다. 은행잎 성분 중 bilobalide가 D.pteronyssinus에 살충효과가 있음을 검증하였으며, 다양한 은행잎 추출조건에 따른 살충실험을 한 결과 48시간 이후 약 68%～80%의 치사율을 보였다. 종합적으로 판단해 볼 때 경제성과 치사율을 고려하면 80℃에서 온수추출물 (GLW80)이 가장 최적추출 조건이다.

A Insecticidal effect of Ginkgo biloba leaves extract was conducted for Dermatophagoides pteronyssinus as a predominant species in korea. D. pteronyssinus has been cultured in constant temperature and humidity chamber at the 25℃ and 75% of relative humidity. The mortality of mites was determined by counting the dead bodies for every hour within 48 hours with pin hall microscope after treated by Ginkgo biloba leaves extract spreaded on 0.1 g of mass cultured media. The sequence of mortality for D. pteronyssinus are as follows, bilobalide was 91.6%, 80℃ water extract was 82.8%, second water fraction was 75%, ethyl acetate fraction from 80℃ water fraction was 73%, first ethyl acetate fraction from 80℃ water extract was 69.4%, putaltrin was 65%, distilled water was 58%, methanol extract was 57.8%, Ginkgolide-A was 57.1%, ethyl acetate fraction of 80℃ water extract was 55%, respectively. From the these results we conclude that the bilobalide is the most effective component in the Ginkgo biloba leaves extract having insecticidal effect on house dust mite.