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초록

영어

Although Energy demands of modern society increase rapidly, curent energy would be exhausted shortly. Therefore development of bio-ethanol production process from cellulose containing materials was extrmly demanded. Therefore development of highly functional cellulase is requisite for this purpose. In this study cellobio-hydrolase (CBH1) gene from
Trichorderma reesei was used to increase cellulase activity by directed evolution and highly functional cellobio-hydrolase was obtained and characterized.

한국어

Cellobiohydrolase (CBH) I 유전자의 확보는 CBH I 유전자 cellulase 생산 균주인 Trichoderma reesei를 배양, 수거하고 액체 질소를 이용하여 세포를 파쇄 후 RT-PCR kit를 이용하여 CBH I gene을 합성하였다. 그 후 발현벡터인 pYGAL에 cloning하였다. CBH I 유전자 앞부분에는 CBH I 단백질이 cell 외부로 분비할 수 있도록 하는 ppL이 포함되었다. CBHI 단백질 발현은 Protein gel 결과를 통하여 발현을 확인하였다. Cellulase 활성을 증대시키기 위한 분자진화 방법 개발은 error prone PCR과 DNA shuffling을 수행하였다. 얻은 CBH I 유전자를 발현 벡터에 삽입하고 효모에 transformation하여 이것을 다시 screening하였다. 1차 screening 후 confirm test하기 위해 DNS (Dinitrosalicylic Acid) 환원당 측정법을 이용하였으며, 이 결과 121-D8, 228-G2, 389-E3, 412-B4, 456-D2의 cellulase 변이체를 획득할 수 있으며, 456-D2의 경우 original CBH I과 비교하여 약 510%의 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 분자 진화 된 cellulase sequence 분석결과 CBH I wild type과 비교하였을 때 121-D8의 경우 변경된 9개의 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 6개, 228-G2의 경우 변경된 7개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 4개, 389-E3의 경우 변경된 13개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 9개, 412-B4의 경우 변경된 9개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 6개, 456-D2의 경우 변경된 10개의 바뀐 염기 중 아 미노산의 변화에 영향을 준 염기는 7개이었다. Cellulase 생산 공정 최적화는 5 L 발효기를 이용하여 고 농도 배양을 실험한 결과 최종 O.D. 120까지 진행할 수 있었으며, 약 1.2 g/L의 cellulase를 얻을 수 있었다. Cellulase 생산 공정 scale-up 5 L 규모에서 확립된 최적 fed-batch 발효 공정을 300 L로 scale-up하여 실험하였다. 최종 O.D.는 약 280 정도이며 cellulase의 발현양은 약 3.2 g/L 수준임을 확인하였다. Cellulase 정제 공정 최적화 결과 80%의 수율과 95%의 순도를 확보하였다.

목차

Abstract
 서론
 재료 및 방법
  Cellobiohydrolase (CBH) I 유전자의 확보
  CBH I 유전자 cloning
  CBH I 단백질 발현
  CBH I 활성을 증대시키기 위한 분자진화 방법 개발
  CBH I 변이체의 screening 방법 개발
  CBH I 생산 공정 Lab-scale에서 최적화
  CBH I 생산 공정 scale-up
  CBH I 정제 공정 최적화
 결과 및 고찰
  Cellobiohydrolase (CBH) I 유전자의 확보
  CBH I 유전자 cloning
  CBH I 단백질 발현
  CBH I 활성을 증대시키기 위한 분자진화 방법 개발
  분자진화된 CBH I sequence 분석
  CBH I 생산 공정 Lab-scale에서 최적화
  CBH I 생산 공정 scale-up
  CBH I 정제 공정
 요약
 REFERENCES

키워드

저자

• 강환구 [ Whan-Koo Kang | 한남대학교 나노생명화학공학과 ] Corresponding author
• 정종식 [ Jong-Sik Jeung | 한남대학교 나노생명화학공학과 ]
• 김형식 [ Hyang-Sik Kim | 한남대학교 나노생명화학공학과 ]
• 김범창 [ Bum-change Kim | 한남대학교 나노생명화학공학과 ]
• 윤지선 [ Ji-Sun Yun | 한남대학교 나노생명화학공학과 ]
• 박형수 [ Hyang-Su Park | 한남대학교 나노생명화학공학과 ]

참고문헌

발행기관

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• 간행물명

  KSBB Journal

• 간기

  격월간

• pISSN

  1225-7117

• 수록기간

  2009~2013

• 십진분류

  KDC 476 DDC 576