Earticle

본 연구에서는 dextransucrase의 효소반응에 의한 dextran 생성기작을 규명하고자 하였다. Dextransucrase에 의한 dextran 생성은 초기당농도 50~150g/l 에 대하여 수행하였고 생성된 dextran은 GPC를 사용하여 분자량 분포를 측정하였다. 이 연구에서 실험한 surcrose 농도범위에서는 surcrose가 primer로 작용하지 않은 것으로 추측된다. 또한 surcrose 농도가 50~100g/l 의 범위에서 확산에의한 surcrose의 물질전달 제약에 의한 중합속도의 감소로 먼저 중간분자량 dextran이 생성되었다가 고분자량 dextran이 생성된다는 것을 알 수 있었다. Surcrose 농도가 100~150g/l 로 증가하면서 중간분자량 dextran 생성기작은 라디칼 중합반응을 따르나 낮은 surcrose 농도에서는 물질전달 제약에 의하여 중합반응속도가 감소되어 중간분자량의 dextran을 생성함을 알 수 있었다.

A qualitative study was made on the mechanism of dextran synthesis by dextransucrase. Enzymatic synthesis of dextran was experimentally studied with initial sucrose concentration from 50g/l to 150g/l. The molecular weight distribution of synthesized dextran was measured by using on-line gel Permeation chromatographic system Sucrose was observed not to work as a primer within the range of concentration tested. At the initial sucrose concentration of 50g/l, dextran with molecular weight of medium range (104-2x106) was synthesized due to the mass transfer limitation of sucrose. The amount of the dextran of medium range decreased with the initial sucrose concentration. Dextran was likely to be synthesized by radical chain polymerization mechanism since the dextran of medium range was not produced at higher sucrose concentrations.

재조합 효모를 이용한 hirudin 발효생산조건의 최적화 연구를 수행하였다. Hirudin 유전자는 GAL10 promoter와 MFal 분비신호, GAL7 terminator와 결합되어 있다. 재조합 효모의 성장속도와 hirudin 최종 농도를 증가시키기 위하여 최적의 배지조성과 배양조건을 결정하였다. 최적의 배지조성과 배양조건은 yeast extract 40g/l, casamino acid 5g/l, 포도당 20g/l, galactose 30g/l, DO 50%, 온도 였다. 이 조건으로 2.5 발효조에서 회분식배양을 수행한 결과 비성장속도는 , 최종 건조균체농도는 30g cell/l, 최종 hirudin 농도는 64mg/l로 나타났다.

The research has been carried out to optimize a recombinant S. cerevisine fermentation process for the production of an anticoagulant hirudin. The structural gene coding for hirudin was combined with the GAL10 promoter for controlled expression, the MFal signal sequence for hirudin secretion, and the GAL7 terminator for transcriptional termination. Growth medium composition and environmental conditions were optimized for maximizing cell growth and final hirudin concentration. The optimized conditions included yeast extract 40g/l, casamino acid 5g/l, g1ucose 20g/l, galactose 30g/l, DO 50% and temperature . These conditions yielded the specific cell growth rate of , the final cell density of 30g cell/l and the final hirudin concentration of 64mg/l in the batch fermentation with a 2.5 jar fermentor.

Bacillus subtilis를 재조합 이종 단백질 생산 균주로 만들기 위하여 포자형성 변이주를 만들었다. 균주는 두 개의 프로테아제가 제거된 균주인 DB104로부터 spoOJ와 spoIIG 변이주를 유전자 조작법에 의해 만들고 두 개의 유전자가 모두 제거된 균주도 만들었다. 이에 목적 aprE 유전자를 삽입 벡터 형태로 만들어 integration시킨 뒤 변이주 각각의 형태적인 변화를 투과성 전자현미경으로 살펴 보았다. 각각 변이주의 모습은 이전에 보고된 것과 거의 일치하였으며 spoOJ spoIIG 이중포자변이주의 경우는 spoIIG 변이주와 더욱 닮은 것을 알 수 있었으며, 훨씬 주름진 것과 같은 투박한 세포벽 및 막을 가지고 있음을 관찰하였다. spoOJ 변이는 포자형성 빈도를 낮추고 aprE 활성을 감소시키는 반면, spoIIG 변이는 포자형성을 거의 하지 않으면서 aprE 활성에 상승효과를 가져왔다. spoOJ와 spoIIG 이중포자변이주는 spoOJ 변이의 효과는 거의 나타나지 않은채, spoIIG와 비슷한 aprE 활성을 보였다.

Sporulation mutants of Bacillus subtilis were developed for overproduction of heterologous proteins. The strains spoOJ spoIIG, and spoOJ spoIIG double mutant were constructed from two pretense-delfted mutant (DB104). The vector containing aprE gene was integrated in the chromosome of each strain, then the morphology of each strain was observed by TEM (trasmission electron microscopy). The morphology of spoOJ mutant and spoIIG mutant coincides with the description of the previous reports, respectively. The sporulating cells of spoOJ SpoIIG double mutation resemble spoIIG mutant more similarly, but with a little rougher cell wall membrane. The spoOJ mutation in B. subtilis gives negative effect on aprE activity with only a decreased sporulation frequency. On the contrary spoIIG mutation increases the aprE activity twice with an undetectable sporulation frequency. In the case of spoOJ and spolIG, i. e. double mutation, the effect of spoOJ on aprE activity seems to be relieved and the double mutant shows more or less the same aprE activity compared to spoIIG mutant.

챙파홍섬무우의 모상근 배양에서 몇 가지 외재 호르몬에 대한 반응을 조사하였던 바, auxins중의 2, 4-D는 안토시아닌의 생성을 촉진하였으며 동시에 뿌리의 탈분화를 유도하였다. Cytokinins은 이식 초기의 비교적 소량의 색소능 촉진효과를 나타내었으며, ABA는 색소의 발현억제 효과를 보이고 GA3 는 색소 생성에 별다른 영향을 마치지 않았다. 1mg/l의 농도에서 2, 4-D 이외의 호르몬은 모상근의 탈분화를 유도하지 않았으며, 모상근의 생장을 대조구 이하로 억제하였다. 2, 4-D와 kinetin를 처리하여 시간경과에 따른 안토시아닌 함량의 변화와 PAL, CHS의 활성변화를 조사하였다. 색소능의 변화를 볼 때, 대조구는 6일 에서 kinetin은 6-9일의 이식초기에 일시적인 색소의 증가를 보였으며, 2, 4-D 처리구는 9엘부터 증가하여 18일경에 peak를 보이며 가장 높은 색소 생성을 나타내었다. PAL의 활성 변화에 있어서는, 대조구에 비하여 kinetin, 2, 4-D처리구 둘 다 활성의 증가를 보이고 kinetin은 6 일에 서 2, 4-D는 9 일에 셔 각각 활성의 peak를 나다내였으며, 특히 2, 4→D 의 경우는 18일에서 또 한번의 약한 활성 증가를 보였다. CHS는, 대조구에서는 이식 후 3일에 활성의 일시적인 증가가 있었을 뿐 이후 계속 낮은 상태를 유지하였고 Kinetin 처리구는 6일에서 활성이 증가하여 9일에 최대활성을 보이고 이후 감소하게 된다. 2,4-D 처리구는 9일부터 활성이 증가하여 18일경 최대활성을 나타내고 이후 비교적 높은 활성수준에서 유지되였다. 이외에 이식 후 hormone free 배지 에서 2주간의 전배양 후 kinetin의 처리는 색소축적에 별다른 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과에 따라, 2, 4-D, kinetin에 의한 안토시아닌 생성의 촉진효과는 PAL, CHS의 활성 증 가와 유의적인 연관을 나타내였으며, 특히 시간경과 에 따른 CHS의 활성 변화와 색소의 축적은 비례하여 색소 생성에 있어 CHS의 rate-limiting 역할을 제시하였다. Kinetin를 포함하는 cytokinins은 뿌리의 상처에 의한 “wound-response"에 따른 배양초기의 색소 발현을 촉진하는 작용을 하는 것으로 사료되었다. 2, 4-D와 kinetin에 의해 발현되는 PAL, CHS의 활성증감의 정도는 물론 peak를 보이는 경과시간에서의 차이는 각기 다른 조절기작을 갖는 Isozyme의 존재에 의한 것으로 추정되었다.정되었다.

When effects of exogenous hormone on hairy root cultures of Raphanus sativs cv. Chungpihongsim examined, the highest anthocyanin synthesis and disorganization were observed when 2, 4-D was supplemented to the culture medium Cytokinins showed early weak induction after transfer and ABA showed inhibitory effect and GA3 showed no effects in anthocyanin synthesis. Hormones except for 2, 4-D in 1 mg/l concentration did not induce disorganization of hairy root and retarded growth of hairy root. Time-course changes in anthocyanin synthesis, phenylalanine ammonia-lyase activity and chalcone synthase activity were examined in culture condition contalning 2, 4-D and kinetin. In a medium containing 2, 4-D, anthocyanin synthesis began to increase on the 9th day and reaching maxima on the 18th day after transfer. Maximum peak of PAL activity appeared on the 3-9th day and another minor peak appeared on the 18th day. CHS activity increased from 9th day, reaching maximum on the 18th day and remained at a relatively high level for culture period. In a medium containing kinetin, anthocyanin synthesis increased temporarily on the 6-9th days, early days after transfer and maintained at a low level for remaining culture period. Peak of PAL activity appeared on the 6th day and CHS activity increased from the 6th days, reaching maxima about 18th day and remained at a relatively high level. In particular, addition of kinetin after preculture in hormone free medium for 2 weeks which was thought of wound healing period showed no effects in anthocyanin synthesis. This results showed that stimulation of anthocyanin synthesis by 2, 4-D and kinetin was meaningfully connected with changes of PAL, CHS activity, and then suggested rate-limiting role of CHS on anthocyanin synthesis in that there is close correlation between anthocyanin synthesis and changes of CHS activity in time-course. Besides, it is considered that cytoklnins involving kinetin stimulated anthocyanin synthesis be due to "wound response" by cutting of young roots, and that difference in time-course peak and PAL, CHS activities expressed by 2, 4-D and kinetin result from occurrence of isozyme which have different regulatory mechanism.mechanism.

강산성 양이온 교환수지를 이용하여 설탕, 포도당이 혼존되어 있는 fructo-oligosaccharides 시럽으로부터 순수한 fructo-oligosaccharides를 분리정제하였다. 분리 조건을 최적화한 결과, 수지탑 운전온도 80℃, 0.25h-1유속 이었으며, 수지탑의 높이와 직경의 비율은 25 이상에서 효과적이었다. 최적 조건에서 4회 분리를 수행한 결과, 분리율은 66%이었으며, 제품의 순도는 96%이었다. 분리된 fructo-oligosaccharides 용액은 양이온 교환수지와 음이온 교환수지가 함께 충전된 혼상 수지탑을 이용하여 염과 색소를 동시에 제거한 후 농축하여 최종제품을 제조하였다

Separation of pure fructo-oligosaccharides from the mixed solution of glucose, sucrose and fructo-oligosaccharides was studied using a cationic ion-exchange resin column. Optimum separation conditions, i.e., temperature, feeding rate and the ratio of column vs. diameter were evaluated, which were found to be 85℃, 0.25h-1 and 30, respectively. At the optimized separation conditions, high-purity fructo-oligosaccharides up to 96% were obtained and the total recovery yield was about 66% after four cycles. After the chromatographic separation, purification to remove the salts and color in pure fructo-oligosaccharides solution was successfully conducted using the mixed-bed of cationic and anionic ionexchange resin columns.

Fructosyltransferase와 glucose oxidase의 혼합효소계를 이용한 고순도 fructo-oligosaccharides 생산반응에서의 수학적 모델을 제안하고 실험적으로 검증한 결과 실험치와 모델 값이 서로 잘 일치하였다. 혼합 효소계에서 두 효소의 kinetic parameters를 구한 결과, fructosyltransferase 단일 효소계에서의 값들에 비해 Km 값들은 감소하였고, Km, Vmax 값들은 증가하였다. 혼합 효소계의 반응메카니즘은 전체적으로 Michaelis-Menten kinetics로 표현할 수 있었고, 제안된 모델을 이용하여 고순도 fructo-oligosaccharides 생산에 이상적인 설탕농도를 예측할 수 있었다.

A simplified mathematical model for the production of high-purity fructo-oligosaccharides by the mixed-enzyme system of fructosyl transferees and glucose oxidase was proposed and compared with the experimental results. The kinetic parameters including Km, Vmax and KiG were estimated at 40℃, in which Km, values decreased and KiG and Vmax values increased compared with those of fructosyl transferees alone. The kinetics of the mixed-enzyme system was successfully described in the form of Michaelis-Menten equations. At the reasonable sucrose concentrations tested, the simulated sugar profiles were of good agreement with the experimental ones.

HEK 세포 배양액 중에 존재하는 scu-PA와 tc-PA의 보다 정확한 측정을 위해 fibrin plate법과 기존의 amidolytic 방법을 변형시킨 측정법을 이용했다. 1%의 저혈청 배지를 이용한 T-flask 배양에서1.65x106 (viable cells/ml)의 최대 세포수에 도달하여 1670(IU/ml)의 scu-PA 생산량을 보였으며 평균 10% 미만이 변환율을 보였다. 또한 Spinner vessel에서의 회분배양시 최대 세포수가 4.43x106(totalcells/ml) 와 1560(IU/ml)의 scu-PA 생산량을 나타냈으며 평균 11.4%의 변환율을 보였다. 연속배양에서는 0.449(1/day)의 비생육속도와 3.13x10-4(IU/cell),의 비생산속도를 보였으며 평균 10.18% 정도의 전환율을 보였다. 이는 회분식 및 유가식 배양 결과와 큰 차이가 없으며 배양공정에 관계없이 약 90% 이상의 회수율이 가능하다는 것을 의미한다

A modified amidolytic assay and a fibrin plate method were used to accurately measure the concentration of single chain urokinase type plasminogen activator (scu-PA) and two-chain urokinase type plasminogen activator (tc-PA) in the spent media.1.65x106 (viable cells/ml) of maximum cell density and 1670(IU/ml) of scu-PA concentration were obtained in 1% serum containing medium. The overall conversion ratio from scu-PA to tc-PA was less than 10%. In the results of batch cultivation in a spinner vessel, 4.43x106(totalcells/ml) of maximum cell density and 1560(IU/ml) of scu-PA concentration was observed. The maximum scu-PA concentration and specific scu-PA Productivity were obtained in 1760(IU/ml) and 3.13x10-4(IU/cell), respectively, from perfusion cultivation. The conveysion ratios from batch, fed-batch and perfusion cultivations were less than 12%, which means that about 90% of scu-PA secreted from the cells can be maintained during the cultivations.

Aspergillus niger 균체로부터 황산암모늄 분별침전, 이온교환 크로마토그래피, 한외여과, 소수성 크로마토그래피 과정을 거쳐 glucose oxidase( EC 1.1. 3.4)를 순수 정제하였다. 최종 정제과정인 소수성 크로마토그래퍼에 의해 소수성은 다르나 glucose oxidase의 활성을 갖는 A, B fraction이 얻어졌고, 그의 비활성도는 각각 2,191, 1,273units/mg이었다. A와 B는 분자량 78,000의 당단백질임이 확인되었으나, HPLC 겔 여과로 측정한 분자량, 최대 흡수 파장, 등전점 등에 차이를 보였다. 효소 A는 B-D-glucose를 특이적으로 산화하였고, 촉매 활성에 대한 최적 온도 는 30℃, 최적 pH는 3.5이었으며, SDS에 대하여 비교적 강한 저항성을 나타내었고, 촉매 기능은 10mM Hg2+에 의해 급격히 억제되었다. 화학 수식 실험 결과 cysteine/ cystine중의 SH기가 glucose oxidase의 활성에 관여하고 있음이 시사되었다.

Glucose oxidase(EC 1.1.3.4) was purified to electrophoretic homogeneity from Aspergillus niger by a combination of ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, and ultrafiltration. Two active fractions A and B, of glucose oxidase were obtained from the hydrophobic chromatography on phenyl sepharose CL-4B. The enzyme A and B were glycoproteins with the same denatured molecular weight of 78, 000 and had specific activities of 2, 191 and 1, 273-units/mg proteins, respectively. But the two enzymes showed differences in native molecular weight that was measured by HPLC gel filteration, maximum absorbtion wavelength and isoelectric point. The enzyme A oxidized B-D-glucose only and was resistant to sodium dodecyl sulfate. Activity optimum was found at 30℃ and pH 3.5. Also the enzyme A was inhibited greatly by Hg2+(10mM). The results of chemical modification experiments suggested that cysteine and cystine residues might be involved in the active site of the enzyme A.

During the last decade enzyme reaction in organic solvent has been studied to show that specificity in buffer is different from that in organic solvent. The specificity of restriction enzyme was effected by various factors such as ionic strength, salt organic solvent and temperature. In this study, restriction enzyme PvuII which is used most frequently in genetic engineering and the substrate was vector pGEM3 whose sequence was already known were used. As a result the recognition sequence site was changed in the presence of organic solvents whose Log P are -1.5∼0. Their specificities were contrast with activities were contrasted. Specificities were not changed in organic solvent easily in inactivating enzyme. We think that the enzyme recognition site was not changed randomly but by preferential order. A recombinant vector which does not contain typical cleavage site CAG↓CTG was cleaved in 20% ethanol solution. This result might show that restriction enzyme could be used to cleave at unusual sites by changing the reaction conditions.

치즈의 숙성 전과정을 잘 설명하여 줄 수 있는 수학식을 만들었다. X(0)와 e2(0) 및 k1값들을 증가시킴으로써 숙성과정을 촉진시킬 수 있었고 낮은 K2값과 높은 a2값을 가지는 신 균주의 탐색도 필요도하다는 것을 알았다. 그러나, 치즈 숙성과정 중 나쁜 치즈맛의 생산을 피하기 위하여서는 낮은 단백질 분해요소 활동도를 갖는 균주가 절대적으로 필요하다. 따라서 이 제안된 수학적 모델식은 치즈덩어리 내에서 일어나는 효소반응들을 잘 묘사하고 있으며, 궁극적으로는 값싸고 질 좋은 치즈를 생산하는데 유용할 것이다.

A model to explain the observed kinetics in a whole process of Cheddar-cheese ripening has been developed. It includes growth and lysis of cells in the cheese matrix, cell-wall bound protelnases and intracellular dipeptidases that are released into cheese upon cell lysis, and the production of dipeptides and amino acids from casein in cheese. Model simulations have been conducted to figure out the crucial factors in the process of the cheese ripening. The influential factors have been found to be the cell numbers and the dipeptidase activity at the beginning of the cheese ripening, and the cell-lysis rate of cheese starters. The simulation results have also suggested the use of a mixed culture as well as the experimental screening for a more suitable organism as a cheese starter hence, the model shows how to accelerate the cheese ripening.

Gellan형 미생물 다당류를 생산하는데 관련된 기초 자료를 얻기 위하여 배지조성, 배양온도 및 초기 pH등에 대한 플라스크 실험을 수행하였으며 이를 근거로 회분식, 유가식 및 연속배양을 실시하였다. 또한 배양액의 비뉴우튼성 유체 특성을 조사하였고 이때의 교반동력을 측정하였다. 플라스크 배양을 통하여 얻은 결과를 이용하여 회분식 배양의 최적조건을 확립하였으며 각종 metabolic parameter들을 추정하였다. 유가식과 연속식 배양을 통하여 생산성 향상을 시도한 결과 유가식과 연속식 배양에서 생산성 향상을 꾀할 수 있었다. 고점성 배양액에서의 물질전달 장해현상을 극복하기 위한 일련의 연구가 필요하다고 사료되며 이로부터 생산성 향상을 크게 기대할 수 있을 것으로 보인다

The Gellan-type polysaccharide produced by Pseudomonas elodea(ATCC 31461) is one of the new heteropolysaccharides, having useful properties as gelling, suspending, stabilizing, emulsifying and binding agents in aqueous systems. Medium compositions for growth stage and production stage are improved. The problems of low cell concentration and poor productivity in highly viscous fermentation were attributed to inadequate mixing accompanied by insufficient oxygen transfer. During continuous culture, cell growth and polysaccharide production were greatly affected by the apparent viscosity, and they showed oscillation behavior, i.e. as the product concentration increases, cell concentration decreases. With improved culture conditions, the productivity of continuous culture increased up to 0.6g/l/hr(6-fold that of batch culture ) at dilution rate, D=0.14hr-1.