Earticle

사구체 혈관간세포 (mesangial cell)의 증식 및 세포외기질 (extracelluar matrix)의 과도한 축적으로 인한 메산지움(mesangium) 확장은 사구체 신증을 야기하는 원인인 신장 섬유화를 초래하는 대표적인 병리현상으로 잘 알려져 있다. 또한 전사인자 Sp1은 transforming growth factor (TGF)-β 1, plasminogen activator inhibitor (PAI)-1, Extracellular Matrix (ECM)을 비롯한 메산지움 확장의 발병에 의해 발현이 증가하는 조절 단백질의 유전자를 활성화시키는 전사인자이다. 본 연구에서는 신장 사구체의 섬유화를 억제하기 위한 유전자 치료를 위해, 전사인자 Sp1 결합 배열이 포함된phosphorothioated (PS)-Sp1 decoy oligodeoxynucleotide (ODN)를 구축하여 사구체 혈관간세포에 도입한 결과 섬유화의 주된 사이토카인으로 알려진 TGF-β1 및 PAI-1의 유전자 발현을 효과적으로 억제하였으며 사구체 혈관간세포의 증식이 현저하게 억제하는 효과를 나타내었다. 이러한 연구결과, 사구체 혈관간세포에 도입된 Sp1 decoy가 전사인자 Sp1의 전사활성을 경쟁적으로 저해함으로써, 신부전 유발 인자로 알려진 TGF-β1 및 PAI-1 등의 발현을 인위적으로 저해되었다. 또한 Sp1-decoy를 이용한 사구체 혈관간세포 증식의 효과적인 차단은 사구체 간질의 기질 축적과 확장을 억제하여 신장 섬유화로의 진행을 막을 수 있는 방법으로의 응용이 기대된다.

Mesangial expansion caused by cell proliferation and glomerular extracellular matrix accumulation is one of the earliest renal abnormalties observed at the onset of hyperglycemia in diabetes mellitus. Transcription factor Sp1 is implicated in the transcriptional regulation of a wide range of genes participating in cell proliferation, and is assumed to play an essential role in mesangial expansion, transforming growth factor (TGF)-β1, plasminogen activator inhibitor (PAI)-1. We have generated a phosphorothioated double-stranded Sp1-decoy oligodeoxynucleotide that effectively blocks Sp1 binding to the promoter region for transcriptional regulation of TGF-β1 and PAI-1. The Sp1 decoy oligodeoxynucleotide suppressed transcription of these cytokines and proliferation of primary rat mesangial cells in response to serum stimulation. These results suggest that the Sp1 decoy oligodeoxynucleotide could bea powerful tool in preventing the pathogenesis of renal hypertrophy.

혈청내 단백질 결핍을 효과적으로 치료하기 위해 여러 가지 방법의 유전자 전달 치료가 연구되고 있다. 그 중에서 빈혈 치료제인 에리스로포이에틴 (EPO)는 가장 활발하게 연구 되어지는 분야중의 하나이다. 본 연구는 궁극적으로 체내의 적혈구 생산의 증가를 기대하는 기존의 유전자 전달 시스템의 개량을 목표로 한다. 이를 위해 플라스미드 DNA 벡터를 경량화하여 세포로의 침투량의 증가를 기대하고, EPO와 함께 에리로포이에시스 (적혈 구생산)에 기여할 수 있는 인터루킨-3 (IL-3)와 트롬보포이에틴 (TPO)을 이용하는 복합 전달 시스템 (co-delivery system)을 구성하여 시너지 효과에 의한 조혈작용의 증가를 기대하였다. 특히 한 개의 벡터에 두 개 이상의 유전자를 삽입하므로 DNA 백신의 산업적인 제조 공정의 감축을 기할 수 있는 장점이 있다. 기존의 벡터을 경량화한 pVAC이라는 벡터를 구성하였는데 이는 pSectagB와 PUC19에서 최소한의 필요한 요소만 조합하여 새롭게 만들어 크기가 2.9 Kb로 기존의 다른 플라스미드 DNA 벡터에 비해 현저히 작은 플라스미드 벡터이다. 복합 전달 시스템을 구성하기 위해 인간 IL-3 유전자와 인간 TPO 유전자를 각각 인간 EPO 유전자와 동시에 삽입하여 구성하였다. in vitro 트랜스펙션 (transfection)을 통해 pVAC의 세포 침투 효율성이 pSectagB보다 우수하고, 쥐에게 주입하여 적혈 구용적율 (hematocrit)를 관찰한 결과 pVAC을 이용한 것이 더 기여하는 결과를 얻었다. 그리고 복합 전달 시스템을 구성하는 여러 플라스미드 DNA를 제작하여 in vitro에서 유전자의 발현을 관찰하였다.

Several gene delivery therapies are being developed for treatment of serum protein deficiency. EPO is one of the most promising therapeutic agent for this treatment which is currently being investigated in depth. This study has the ultimate purpose of improving the gene delivery system for an increase of red blood cell production. A plasmid DNA was constructed smaller than other plasmids for an increase in penetration into animal cells, and two genes were cloned into each vector as a co-delivery system to express erythropoietin, and interluekin-3 or thrombopoietin, which can act on erythroid cell, thus activating hematopoiesis synergically. This co-delivery system has an advantage of decreasing the labour required for industrial production of DNA vaccine. A new plasmid vector, pVAC, in size 2.9 kb, was constructed with the essential parts from PUC 19 and pSectagB, which is much smaller than other plasmid vector and is the size of 2.9 kb. Co-delivery system was constituted by cloning human erythropoietin with each of human interluekin-3 gene or human thrombopoietin gene into both pVAC and pSectagB. As a result, the transfection efficiency of pVAC was higer than that of pSectagB in vitro, and hematocrit level of the mice injected with pVAC is higher than that of other mice. And co-delivery system, made of several plasmid DNAs, was expressed in vitro.

4종 한약재에 대한 70% 에탄올 추출물의 Helicobacter pylori 세포 내 urease 활성억제능은 한약재 추출물을 넣지 않은 대조군과 비교하여 소목 (Caesalpinia sappan L.) 추출물의 경우 84%, 연교 (Forsythiae Fructus)의 추출물의 경우 72%, 애엽 (Artemisia asiatica Nakai) 추출물의 경우 31%이었다. 그러나 애엽의 80% 메탄올 추출물을 2차로 물, 에틸아세테이트 및 부탄올로 분획하였을 때 에틸아세테이트 분획에서 urease 활성억제 능력이 90%로 향상되었다.

Ethanol (70%) extract of Caesalpinia sappan L. and Forsythiae suspensa Vahl. showed 84% and 72% of anti-urease activity against Helicobacter pylori, respectively. Among the fraction of Artemisia asiatica Nakai extract using methanol (80%), water, ethyl acetate and butanol ethyl acetate fraction showed 90% of the anti-urease activity.

본 연구에서는 유도성이며 양방향성 promoter인 GAL1-GAL10 promoter에 사람 ferritin H- 및 L-chain 유전자 (hfH & hfL)를 연결하여 재조합 플라스미드를 구축하고 이들을 S.cerevisiae 2805에 형질 전환시켜 두 외래 유전자를 동일 세포내에서 성공적으로 발현시켰다. 균주 Y1H10L과 Y1L10H에 있어서 ferritin 발현은 여러 시험 배지 중 2% galactose를 포함하는 배지에서 가장 높게 나타났으며 이틀간 배양 시 subunit의 총 발현양이 각각 전체 수용성 단백질의 약 22%와 15%에 해당하였다. 각 균주에서 발현된 H 및 L subunit들은 비변성 젤을 사용한 전기영동의 결과 자발적으로 이형집합체로 조합되어짐이 확인되었고, 또한 철 축적의 활성을 보였다. 재조합 ferritin 이형집합체를 분리하여 H:L subunit의 함량을 분석한 결과 발현된 subunit의 비율과 일치하였다. 재조합 효모 균주 Y1H10L과 Y1L10H를 14.3 mM ferrous sulfate와 반응시켰을 때, 세포 내 철의 농도는 대조균주의 농도에 비해 각각 1.7배와 2.0배 증진되었음을 보였다. 재조합 효모에서의 철 흡수량의 증가는 ferritin 발현율이나 subunit의 상대적인 발현양과 밀접한 관련이 있을 것으로 유추되었다.

Human ferritin H- and L-chain genes (hfH and hfL) were cloned into the yeast shuttle vector YEp352 containing the GAL1 (galactokinase) and GAL10 (epimerase) divergent promoters and the vectors constructed were used to transform Saccharomyces cerevisiae 2805. SDS-PAGE displayed expression of the introduced hfH and hfL in both recombinant strains of Y1H10L and Y1L10H. The ferritin subunits, that represented ca. 22% and 15% of the soluble proteins in Y1H10L and Y1L10H, were spontaneously assembled into active ferritin heteropolymers. The H subunit content of the purified recombinant human ferritin heteropolymers was proven to reflect the relative expression yield of the subunits. When the cells of 2d culture were incubated with 14.3 mM Fe(II), the cellular iron concentration of Y1H10L and Y1L10H was 1.7 and 2.0 times, respectively, that of the control strain. It is assumed that increase in the iron uptake of the recombinant yeasts is closely related to ferritin expression and H subunit content.

Alcaligenes latus와 Comamonas acidovorans의 플라스크 및 회분식 배양을 통하여 균체성장과 P(3HB-co-4HB) 합성 특성을 알아보았다. C. acidovorans의 비성장속도는 yeast extract 농도에 따라 증가하였고 1,4-butanediol 농도에 따라 감소하였으며, 최적 glucose 농도는 20 g/L였다. C.acidovorans의 1단 플라스크 배양에서 최종 균체농도 및 PHA 함량은 초기 1,4-butanediol : glucose의 비율이 증가함에 따라 감소하였으나 4HB 함량은 점점 증가하여 탄소원으로 1,4-butanediol 만을 20 g/L 공급하였을 경우 균체성장은 매우 낮았으나 100 mol%의 P(4HB) homopolymer를 얻을 수 있었다. A. latus의 비성장속도는 γ-butyrolactone 농도에 따라 감소하였으며, 최적 sucrose 농도는 10 g/L였다. A.latus의 회분식 배양에서 탄소원인 sucrose의 농도를 10 g/L로 고정하고 γ-butyloractone의 농도를 2~10 g/L까지 변화하여 실험한 결과 γ-butyloractone 농도가 증가할수록 4HB 함량 역시 증가함을 보였으며, 초기 γ-butyloractone (g/L) : sucrose (g/L)의 비가 10 : 10일 때 19 mol%의 4HB를 포함하는 P(3HB-co-4HB)를 얻었다.

Characteristics of cell growth and poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) [P(3HB-co-4HB)] synthesis was investigated through flask and batch cultures of Alcaligenes latus and Comamonas acidovorans. The specific growth rate of C. acidovorans increased with yeast extract concentration and decreased with 1,4-butanediol concentration. Optimum glucose concentration for growth of C. acidovorans was 20 g/L. In one-step flask cultures of C. acidovorans, final dry cell weight and PHA content decreased with the ratio of 1,4-butanediol to glucose, while the 4HB fraction in copolymers gradually increased to 100 mol% with an initial 1,4-butanediol concentration of 20 g/L as single carbon source. The specific growth rate of A. latus decreased with γ-butyrolactone concentration and optimum sucrose concentration for growth was 10 g/L. In batch cultures of A. latus, 4HB fraction increased with initial γ-butyrolactone concentration. P(3HB-co-4HB) with 19 mol% 4HB was obtained when the initial ratio of γ-butyloractone (g/L) to sucrose (g/L) was 10 : 10.

Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1149로부터 sucrose를 기질로 하여 효소 반응기에 phosphate를 첨가하면 fructose와 G-1-P를 합성하는 sucrose phosphorylase을 정제하였다. 배양액을 hollow fiber filtration (30 kDa cut off)을 이용하여 농축하고 Toyopearl DEAE 650 M column과 두 번의 DEAE-Sepharose column chromatography를 통해 16% yield를 갖는 정제된 1149SPase 25.7 (U/㎎)을 얻었다. 정제한 1149SPase는 분자량이 56 kDa (10%, poly acrylamide gel)이었고, 37℃와 pH 6.2～6.5에서 효소 최적 활성을 보였다. 또한, sucrose를 기질로 한 Km과 Kcat 값은 각각 6.0 mM과 1.62/s로 계산 되었고, N-terminal아미노산 서열은 MEIQNKAM이였다. 1149SPase의 결정은 20mM calcium chloride dihydrate, 100 mM sodium acetate trihydrate pH 4.6, 30% 2-methyl-2,4-pentanediol의 혼합 용액을 저장액과 건조액으로 사용한 hanging drop diffusion방법으로 얻을 수 있었다. Salicin과 salicin alcohol을 isomaltose를 이용한 disproportionation 반응과 sucrose을 이용한 수용체 반응으로 당전이 시킨 화합물을 합성하였다. 이러한 1149SPase의 disproportionation반응과 수용체 반응 특성은 여러 신소재 개발에 활용 가능하겠다.

Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1149 produces various glucosyltransferases for the synthesis of dextran, levan and glucose-1-phosphate using sucrose as a substrate. A sucrose phosphorylase (1149SPase) was purified from L. mesenteroides NRRL B-1149 culture by using hollow fiber filtration (30 kDa cut off), Toyopearl DEAE 650 M column chromatography and following two times of DEAE-Sepharose column chromatographies. The specific activity of the purified 1149SPase was 25.7 (U/㎎) with 16% yield. The 1149SPase showed a molecular size of 56 kDa on denatured 10% SDS-PAGE. The N-terminal amino acid sequence of the enzyme was MEIQNKAM. The optimum pH and temperature of this enzyme were 6.2～6.5 and 37℃, respectively. It had an apparent Km of 6.0 mM and Kcat of 1.62/s for sucrose. 1149SPase crystal was formed by hanging drop diffusion technique using 20 mM calcium chloride dihydrate, 100 mM sodium acetate trihydrate pH 4.6 and 30% 2-methyl-2,4-pentanediol as vaporizing and reservation solution. The 1149SPase catalyzes transferring of glucose from isomaltose or sucrose to salicin and salicyl alcohol by disproportionation reaction or acceptor reaction and synthesized two acceptor products, respectively.

Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1149로부터 불용성 glucan과 수용성 fructan을 합성하는 효소를 생산하는 최적 배지 조건을 정해 주고, 그 효소들을 정제하였다. 효소의 최적생산 배지조성 결정은 반응 표면 분석법을 이용하였고, 최적배지 조성은 0.75% yeast extract, 0.72% peptone, 1% K2HPO4 그리고 2.17%의 sucrose였으며, 이 조건에서 생산된 효소의 활성은 GTase의 경우에는 0.9 U/㎖였고 FTase의 경우에는 0.96 U/㎖였다. DEAE-Sepharose column chromatography 방법을 이용하여 2회 반복 정제 후 불용성 glucan을 생산하는 GTase와 수용성 fructan을 생산하는 FTase의 분획을 분리하 였다. FTase의 특성을 나타내는 분획들은 Sephadex G-150 column 정제 이후에 210 kDa의 활성을 나타내는 밴드가 전기영동 후 확인되었다. GTase의 특성을 나타내는 분획은 Bio-gel P-100 column 정제 이후에 180 kDa 크기의 활성을 나타내는 밴드가 확인이 되었다. 이 효소들이 합성한 다당의 구조는 methylation 및 13C NMR 분석으로 확인하였으며, 불용성 glucan은 α(1→6)과 α(1→3)의 결합을 가지는 alternative comb dextran으로 확인이 되었고, 수용성 fructan은 levan임을 확인하였다. 효소를 이용하여 sucrose을 공여체로 한 수용체 반응연구를 수행하였으며, 여러 가지 수용체에 sucrose의 glucose가 전이된 산물을 얻을 수 있었다.

The optimal condition for the production of a glucan and a fructan synthesizing enzymes from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1149 were studied based on the different medium compositions. Response surface methodology was applied to find the optimistic condition showing the relationship between the fermentation response (enzyme activities) and the fermentation variable concentrations of yeast extract, peptone concentration, K2HPO4 concentration and sucrose. Optimum medium composition for both enzymes production was 0.75% yeast extract, 0.72% peptone, 1% K2HPO4 and 2.17% sucrose. Using this medium, the activities produced in culture was 0.90 U/㎖ for glucosyltransferase (GTase) and 0.96 U/㎖ for fructosyltransferase (FTase). After purification of 1149FTase by consecutive chromatographies using Sephadex G-150 and DEAE-Sepharose, a 1149FTase of 210 kDa on 7% poly acrylamide gel was isolated and it synthesized soluble fructan. The 1149GTase showed a band of 180 kDa on 8% poly acrylamide gel after purification using Bio-Gel P-100 gel chromatography and DEAE-Sepharose ion exchange chromatography and it synthesized insoluble glucan. The linkages of polymers were determined by methylation using Hakomori reagent and following NMR analysis. The glucan was composed of α(1→6) and α(1→3) linkages and the fructan was levan.

형질전환된 현탁 식물세포 배양을 통한 의료용 단백질의 생산은 post-translational modification, 동물유래 바이러스에 대한 안전성, 저가의 배양 배지, 쉬운 정제과정, 대규모 생산 등의 장점을 가지고 있지만 외래 단백질의 낮은 발현율, 배양환경 변화에 따른 세포 생존율의 저하 등 해결해야할 과제가 많다. 따라서 배양공정 개발을 통한 세포 생존율 증진에 관한 연구가 수행되어야 하며, 이를 토대로 상업적 생산을 위한 대량 배양에 응용되어야 할 것이다. 본 연구에서는 먼저, 두꺼운 세포벽과 응집체를 형성하고 있어 생존 단일세포의 정량이 어려운 형질전환된 현탁 식물세포의 상대적 생존율 정량법을 구축하였으며, 세포의 형태적 변화, DNA 절편화, caspase-3 정량 등을 통하여 현탁 식물세포에서도 동물세포에서와 마찬가지로 여러 스트레스에 의해 apoptosis가 일어남을 확인하였다. 또한 배양환경 변화에 따른 세포생존율의 저하 및 apoptosis의 증가를 억제하기 위하여 여러 가지 배지 첨가물 (nicotinamide, 3-aminobenzamide, 항산화제 등)을 선택하여 다양한 시기와 환경에서 첨가함으로써 목적 유용 단백질인 hGM-CSF의 생산성을 최대 2.5배까지 증진시켰다. 부가적으로 cold stress에 의한 급격한 세포생존율 감소와 apoptosis 증가는 ascorbic acid와 glutathione에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다. 결과적으로 형질전환된 현탁 식물세포의 생존율과 apoptosis 정량법을 기초로 하여 항산화제를 배지에 첨가함으로써 세포 생존도 증진과 apoptosis 억제를 통한 재조합된 의료용 단백질인 hGM-CSF 생산성을 증진시킬 수 있었다.

Production of therapeutic proteins by transgenic plant cell suspension cultures is an attractive system alternative to the other expression system. However, plant cell cultures have shown low expression level of foreign proteins and decreased cell viability by the changes of culture conditions. Therefore, it is necessary to enhance cell viability during the culture period. In this study, a quantitative analysis technique was designed to measure relative cell viability for plant suspension cells which have cell wall and aggregates. It was found that the programmed cell death of plant cells by apoptosis was essentially linked with the apoptotic pathway of animal cells. Therefore, effects of nicotinamide, 3-aminobenzamide and antioxidants on cell viability and apoptosis were examined in transgenic Nicotiana tabacum cells producing hGM-CSF. With those additives, cell viability could be maintained and apoptosis could be redued. In the result, the extracellular production of hGM-CSF could be enhanced 2.5 fold. It was also found that the supplementation of glutathione and ascorbic acid suppressed both the cold stress-induced decrease in cell viability and the increase of total genomic DNA fragmentation.

본 연구에서는 참나무 목초액에 대한 항균․항산화 활성에 대해 연구하였다. 참나무 목초액을 이용하여 식중독에 원인이 되는 B. cereus나 포도상구균, 폐혈증의 원인이 되는 V.vulificus등과 같은 병원성 균과 일반 미생물에 대한 항균효과를 실험하였다. Paper disc법에 의한 항균검정에서는 거의 모든 균에 대해 생육저지환이 나타났다. 또한 목초액의 농도에 따른 항균 활성은 균주에 따라 다르지만, 2% (v/v) 이상에서 뚜렷한 항균 활성을 나타내었다. 목초액을 산성, 페놀성, 염기성, 중성 분획으로 각각 나누어 DPPH를 이용한 라디칼 소거능 이용한 항산화 활성을 측정하여 ED50 값으로 비교한 결과, 대조군인 ascorbic acid가 가장 높았으며, BHA와 BHT도 높게 나타났다. 목초액의 분획에서는 페놀성 분획에서 항산 화력이 가장 높게 나타났다. 그러나, 산성분획 및 염기성, 중성분획에서는 뚜렷한 항산화 활성은 나타나지 않았다.

The antimicrobial and antioxidative activities were investigated to confirm the utility of wood vinegar. Antimicrobial activity was performed by paper disc method and liquid culture. The growth inhibition was observed in all microbial species at a dose of as low as 25 μL of wood vinegar by paper disc method. Also, in liquid culture, S. cerevisiae and P. aeruginosa were more inhibited the growth than others in the concentration of 2% (v/v). For measuring of antioxidative activity, wood vinegar was fractionated with acidic, phenolic, basic and neutral fraction; and their antioxidant activities were measured by the radical scavenging effect on DPPH radical. In four fractions, phenolic fraction showed high antioxidative activity.

당알콜인 솔비톨을 화학촉매 p-TSA로 탈수반응하여 제조한 솔비탄을 고정화 리파제 Novozym 435를 이용하여 솔비탄 메타크릴레이트를 합성하였다. 솔비탄 메타크릴레이트를 효소적으로 합성한 결과 아실 공여체로 메틸 메타크 릴레이트를 사용하여 솔비탄 초기농도 50 g/L, 효소함량 3% (w/v), 몰비 1 : 3, 반응온도 50℃, 반응시간 42시간에서 약 65%의 수율을 얻었다. 아실 공여체의 종류에 따른 수율의 변화에 현격한 차이를 나타내어 methacrylic acid의 경우에 최대 전환율이 60℃에서 약 18%이었고, ethyl methacrylate의 경우에는 50℃에서 약 65%를 보였으며, 그리고 vinyl methacrylate에서는 50℃에서 약 80%로 가장 높은 전환율을 나타냈다.

In this research, the chemo-enzymatic synthesis of sorbitan methacrylate was investigated to optimize reaction conditions. Firstly, sorbitan was manufactured by sorbitol cyclic reaction in the presence of ρ-toluenesulfonic acid (ρ-TSA) as catalyst material. Secondly, sorbitan methacrylate was synthesized by immobilized lipase Novozyme 435 with acyl donors in t-butanol. As a result of enzymatic synthesis of sorbitan methacrylate, the conversion yield reached about 65% in the condition of initial sorbitan conc. 50 g/L, enzyme content 3% (w/v), molar ratio 1:3, reaction temperature 50℃ and reaction time 42 hrs using methyl methacrylate as acyl donor. Comparing with acyl donors and reaction temperature, the conversion yield reached about 18, 65 and 80% with methacrylic acid, methyl methacrylate and vinyl methacrylate as acyl donor, respectively. And optimum reaction temperature was 60, 50, and 50℃, respectively

염색폐수내의 미생물 활성과 생분해 가능한 COD를 평가하여 효과적인 운전조건을 제시하고자 산소소모율을 측정하였다. 파일럿 플랜트 내로 유입되는 COD 농도 변화에 대한 최대산소소모율은 유입되는 농도가 높을수록 높은 값을 나타내어 COD와 최대산소소모율과의 상관관계를 통해 유입되는 COD농도에 미생물 활성을 예측할 수 있다. 또한 본 연구는 생물학적으로 분해 가능한 물질을 산소소모율 측정을 통한 소모된 산소의 양과 생산계수에 의해 계산하였으며, 생물학적 분해 가능한 COD 농도와 초기 COD 농도와의 차를 통해 난분해성 물질도 계산할 수 있었다.

Oxygen uptake rate (OUR) was used as an indicator of microbial activity. In this study OUR at dyeing wastewater in the pilot plant was monitored to examine biological activity. Correlation between inlet COD concentration and maximum OUR showed that maximum OUR was proportional to inlet COD concentration. Changes in the OUR values reflected the changing waste load in the reactor. Consequently, OUR can be used to estimate biological activity of inlet COD concentration. This study showed that biodegradable COD at dyeing wastewater could be calculated from OUR and yield coefficient. Non-biodegradable COD was able to be calculated from a difference between initial COD concentration and biodegradable COD.

본 연구에서는 고속 탐색 발굴의 핵심으로 사용되는 질량분석기를 이용하여 저 분자랑 생화학 물질을 분석할 경우의 문제점들인 고 휘발성, 이온화의 어려움, 그리고 동중 원소분석 문제를 유도체화 반응을 통하여 기존의 분석 방법보다 효율적이며 신속한 분석 방법으로 대처할 수 있는 고속 탐색발굴 방법을 새롭게 제시하였다. 특히, 트랜스아미나제 반응분석 시 문제가 디는 케토산을 옥심 유도체화 반응을 통하여 선택적으로 질량 차이를 유도할 수 있었으며, 또한 생성된 유도체는 질량 분석기를 통하여 케토산 1 mM부터 10 mM내에서 정량화가 가능함을 보여주었다. 이 방법을 통하여 트랜스아미나제 효소 반응을 분석할 수 있었으며, 효소의 기질특이성을 한번에 쉽게 분석할 수 있는 방법으로 응용되었다. 또한, 사용된 효소의 특성을 쉽게 파악할 수 있는 매우 간편하고 정확한 방법으로 평가되었다. 이 방법은 기존의 질량분석기의 응용 범위를 다양한 저 분자량 물질 분석까지 확대할 수 있을 것이다. 본 연구에서 제시한 유도체화 반응은 반응 용액을 가지고 직접 반응하고 매우 쉽게 구현이 가능하여 효율성과 분석 감도를 증가시킬 수 있었다. 본 연구 결과에서 보듯, 이 방법을 통하여 동 중량체 (isobaric compounds)의 저 분자량을 질량 차이를 유도하여 분석할 수 있으며, 특정 효소의 기질 특이성 및 그 효소의 종류를 구별할 수 있음을 알 수 있었으며 이를 바탕으로 미지의 효소에 대한 기능을 예측할 수 있는 방법까지 응용될 것으로 기대된다.

A derivatization method in mass spectrometry for small molecular analysis was developed to solve the problems of volatility of many analytes, difficult ionization of analytes, and undiscriminating isobaric analytes. This derivatization method, oximation of α-ketoacid, in the transaminase reaction leads to change of mass difference between amine reactants and ketoacid products. In addition, regardless of the kinds of ketoacid, the linear relationship between the peak intensity and its concentration (from 1 mM to 10 mM) shows that quantitative analysis of the conversion of the reaction can be executed by the analysis of peak intensity of the corresponding oximated ketoacids. Furthermore, this method can be used for identifying transaminase as well as determining its substrate specificity

미생물 고정화를 위하여 PU 폼을 세 가지 처리 방법으로 처리하였다. 플라즈마 처리, 플라즈마 유도 그라프팅, 플라즈마 유도 그라프팅 후 플라즈마로 재처리 방법을 사용하였다. 플라즈마 처리는 bacteria adhesion에 큰 효과를 주지 못하였고, 아크릴산의 플라즈마 유도 그라프팅은 adhesion을 세 배 이상 증가시켰다. Bacteria의 adhesion 성능 향상은 표면의 친수성을 증가시키고 새로운 groove나 cavity들을 형성시킴으로 가능하였다. 반면, 그라프팅 후 plasma re-treatment는 미생물 고정화를 크게 향상시키지 못하였다. SEM 관찰을 통하여 대부분의 E.coli는 groove나 cavities라는 shear-free area에 서식함을 알 수 있었다. PU폼의 bacteria adhesion은 미생물과 고분자 표면 사이의 정전기적 인력이나 van der Waals 인력에 의해 주로 영향을 받는다고 사료된다.

A reticulated PU-g-PAAc foam was modified through the surface treatment of PU foam by one atmospheric pressure plasma. The synthesized PU-g-PAAc foam was prepared for the purpose of immobilizing microbial organisms. We also attempted different plasma treatment methods including simple plasma treatment, plasma induced grafting and plasma induced grafting followed by plasma re-treatment. The effect of grafting on equilibrium water content (EWC) of PU forms was examined by swelling measurements. Adhesion test was performed to investigate the effect of different plasma treatment methods on the improvement of microbial immobilization. Two foams modified by plasma induced grafting and plasma re-treatment after grafting showed 2.7 and 3.0 fold higher microbial immobilization than unmodified one, respectively. Meanwhile, simple plasma treatment showed a little enhancement. FT-IR analysis of each sample verified the contribution of surface functional groups on the enhancement of microbial immobilization. SEM observation confirmed microbial adherence.

본 연구에서는 이차원 전기영동을 통한 단백질분석을 통해 선정한 점들을 MALDI-TOF를 이용하여 peptide 값을 얻었으며 그 peptide 값을 웹 사이트의 데이타베이스와 비교하여 glucose-6-Phosphate isomerase, phosphoglucomutase, β-1,3-glucan synthase, glucokinase와 같은 주요 대사산물들을 검출하였다. 그리고 함께 검출된 단백질에는 uracil phosphoribocyl transferase와 ribosome recycling factor도 있었다. 본 연구에서는 이를 바탕으로 더 많은 연구를 통하여 이미 검출된 단백질에 대한 재검증을 진행하고 더 많은 단백질들을 검출하여 β-1,3-glucan이 생성되는 상세한 합성경로를 밝혀내고자 하였다. 본 연구를 통하여 β-1,3-glucan 합성에 관여하는 단백질들을 밝혀내고 농도를 측정하면 수학적으로 모델링 할 수 있으며, 이를 통하여 세포 내부를 최적화 시켜 글루칸 생산성을 높일 수 있다. 또한, 율속단계의 반응을 찾아 그 반응을 촉진하도록 함으로써 향후 더 높은 생산성을 갖는 변이주를 만드는 것이 가능할 것이다.

Matrix Assisted Laser Desorption ionization Time of Flight (MALDI-TOF) was used for enzymes identification related to β -1,3-glucan synthesis. Agrobacterium sp. ATCC31750 was cultivated with two stage Continuous Stirrer Tank Reactor (CSTR) and the cells were harvested and their protein profiles were analysed by two dimensional electrophoresis. The specific enzyme spot was treated with trypsin and analysed by MALDI-TOF to get peptide molecular weight. The peptide molecular weights were matched with Agrobacterium tumefacience's Data Base from the matrix science site, then could identify the avaliable key enzymes. In this study, we identified key metabolite of synthesis of beta-1,3-glucan, such as glucose-6-phosphate isomerase, phosphoglucomutase, β-1,3-glucan synthase and glucokinase, and we also identified uracil phosphoribocyl transferase and Ribosome recycling factor also.

E. faecalis RKY1을 사용한 유가식 배양을 통하여 기질저해를 받지 않도록 하여 발효조 내의 젖산 농도를 최대화시키고자 하였다. 유가식 배양에 의한 젖산발효는 생성물인 젖산으로 인한 저해가 심하여 부피생산성이 감소하였지만, 네 가지 형태의 유가식 배양을 실험한 결과 발효 도중에 발효액을 수 회 제거하고 질소원이 제한되지 않은 배지를 수회 공급하는 간헐적인 유가식 배양의 경우에 가장 나은 결과를 얻을 수 있었으며, 이 경우 발효 84시간째 생산된 젖산의 농도는 최대 224.8 g/L까지 증가하였고 젖산에 대한 총괄 수율은 0.84 g/g, 비생산속도는 0.092 g/g․hr, 그리고 부피생산성은 2.7 g/L․hr로 얻을 수 있었다.

Fed-batch cultures of Enterococcus faecalis RKY1 were performed to maximize the L(+)-lactic acid concentration in the bioreactor. The highest lactic acid concentration was obtained at around 225 g/L by intermittent feeding the concentrated glucose media containing 500 g/L of glucose and 15 g/L (or 75 g/L) of yeast extract. However, in all fed-batch cultures, volumetric productivities of lactic acid gradually decreased due to the inhibitory effect of lactic acid produced during the fermentation. The highest value of lactic acid concentration obtained in this work corresponded to around 1.5-fold increase compared with conventional batch fermentation.