Earticle

나노기술과 바이오기술의 융합연구에 의해 나노바이오기술이 발전되고 있다. 나노바이오기술의 중요한 응용연구 중의 하나로서, 진단이나 바이오센서 분야에서 단백질-단백질 및 단백질-바이오물질간의 상호작용을 연구하기 위한 단백질 센서 칩이 개발되어 왔다. 본 논문에서는 단백질의 선택적 고정화를 위한 새로운 생체고분자 기질로 PHA를 이용하는 첫 번째 예로서, 단백질-단백질 및 항원-항체 반응의 구현을 나타내고자 하였다. 본 시스템은 PHA 표면 위에서 PHA depolymerase의 SBD와의 선택적 결합에 기반한 것으로, PHA depolymerase의 SBD와 융합된 단백질이 PHA가 코팅된 표면 위에 spotting 될 수 있고 미세접촉인쇄방법에 의해 PHA 위에 미세패턴이 제조되어지는 것을 알 수 있었다(52, 53). 이러한 새로운 전략이 PHA depolymerase의 SBD와 다른 단백질을 융합함으로서 미세 spotting과 미세패터닝이 가능하게 되었고 항원-항체의 생물학적 반응을 통해 많은 바이오센서 칩 연구에 응용될 수 있음을 확인하였다. 또한, PHA 마이크로비드에도 PHA depolymerase의 SBD와 융합된 단백질을 고정시킴으로서 항원-항체 반응을 유도할 수 있음을 확인하였다(54). PHA의 구조를 변경하여 PHA 기판, PHA 필름, PHA 미세패턴, PHA 마이크로 비드 등을 이용할 수 있으며 multiplex assay를 동시에 진행할 수 있는 다양한 융합 단백질을 사용할 수 있을 것이다. 생분해성 플라스틱으로서 성공적으로 개발된 PHA를 이용한 새로운 플랫폼 기술이 PHA depolymerase의 SBD를 이용함으로서 특이적이고 선택적인 단백질의 고정화에 이용될 수 있음을 확인하였다. 본 전략이 다양한 단백질-단백질 및 단백질-바이오물질반응을 이용한 바이오칩 및 바이오센서의 응용연구에 유용하게 사용될 것이다.

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are a family of microbial polyesters that can be produced by fermentation from renewable resources. PHAs can be used as completely biodegradable plastics or elastomers. In this paper, novel applications of PHAs in biosensor are described. A general platform technology was developed by using the substrate binding domain (SBD) of PHA depolymerase as a fusion partner to immobilize proteins of interest on PHA surface. It could be shown that the proteins fused to the SBD of PHA depolymerase could be specifically immobilized onto PHA film, PHA microbead, and microcontact printed PHA surface. We review the results obtained for monitoring the specific interaction between the SBD and PHA by using enhanced green fluorescent protein, red fluorescent protein, single chain antibody against hepatitis B virus preS2 surface protein and severe acute respiratory syndrome coronavirus surface antigen as model proteins. Thus, this system can be efficiently used for studying protein-protein and possibly protein-biomolecule interactions for various biotechnological applications.

바이오센싱 디바이스는 본질적으로 생체인식소재와 신호전달장치로 구성된 집적화, 소형화된 분석시스템으로 많은 장점을 가지고 있다. 고민감도, 선택도, 단순성, 다성분측정능력, 즉시측정능력 뿐 아니라 매우 작고, 고가의 장치가 필요없는 장점이 있다. 바이오센싱 디바이스의 개발을 위해서는 두 가지의 핵심요소기술이 필요하다. 이것은 생체인식소재모듈의 제작 (리셉터 개발 및 고정화기법)과 신호발생기술을 포함한 신호전달장치의 개발이다. 효소, DNA/RNA, 단백질, 세포 등의 다양한 생체인식소재가 바이오센싱 디바이스 제작을 위해 이용되어져 왔고, 신호전달시스템도 전기화학적, 광학적, mass sensitive transducer를 중심으로 매우 활발히 연구되어져 왔다. 본 고에서는 최근 개발된 바이오센싱디바이스에 대해 다루고, 향후 전망에 대해 논하고자 한다.

Bio-sensing devices, which are basically integrated and miniaturized assay systems consisted of bioreceptor and signal transducer, are advantageous in several ways. In addition to their high sensitivity, selectivity, simplicity, multi-detection capability, and real time detection abilities, they are both very small and require relatively inexpensive equipments. Two core technologies are required to develop bio-sensing devices; the fabrication of biological receptor module (both of receptor development and immobilisation of them) and the development of signal transducing instruments containing signal generation technique. Various biological receptors, such as enzymes, DNA/RNA, protein, and cell were tried to develop bio-sensing devices. And, the signal transducing instruments have also been extensively studied, especially with regard to electrochemical, optical, and mass sensitive transducers. This article addresses bio-sensing devices that have been developed in the past few years, and also discusses possible future major trends in these devices.

DNA 마이크로어레이는 바이오칩의 발전에서 가장 주목받으며 발전하고 있는 분야로서 이에 대한 연구가 점차 확장하고 있다. DNA나 RNA 등 유전자의 매우 느린 확산속도를 극복하기 위하여 마이크로플루딕 바이오칩이 DNA마이크로어레이에 적용되는 최근의 학술적인 사례들을 연구, 비교 하였다. DNA 마이크로어레이에 적용된 미세유체바이오칩은 상당수가 효율적인 hybridization을 달성하기 위한 믹싱 시스템이 많이 보고되었으며, 이 총설에서는 그에 대한 분석을 수행하여 유전자 hybridization 강화를 이룬 시스템에 대한 최근 동향을 가늠할 수 있게 하였다. 특별히 PDMS를 이용한 마이크로 펌프의 적용 등, 앞으로의 미세유체 DNA 마이크로어레이 발전가능성과 모델링의 한계점 등을 정리 분석해 보았다.

Recently, microfluidic biochips for DNA microarray are providing a number of advantages such as, reduction in reagent volume, high-throughput parallel sample screening, automation of processing, and reduction in hybridization time. Particularly, the enhancement of target:probe hybridization by decrease of hybridization time is an important aspect highlighting the advantage of microfluidic DNA microarray platform. Fundamental issues to overcome extremely slow diffusion-limited hybridization are based on physical, electrical or fluidic dynamical mixing technology. So far, there have been some reports on the enhancement of the hybridization with the microfluidic platforms. In this review, their principle, performance, and outreaching of the technology are overviewed and discussed for the implementation into many bio-applications.

현재 많은 대학과 기업에서 다양한 방법으로 상용화가 가능한 protein microarray의 개발을 위해 많은 연구를 집중하고 있다. Protein microarray의 제작 및 분석 조건을 최적화하기 위한 연구도 진행되고 있지만 protein microarray로부터 얻은 분석 결과를 모든 연구자들이 공유하고 통합하기 위한 노력이 절실한 실정이다. 뿐만 아니라, PCR 같은 무한 확장 방법이 존재하지 않는 단백질의 특성을 고려할 때, 좀 더 실용적인 protein microarray를 많이 만들기 위해 서는 수많은 단백질들과 결합할 수 있는 특이성이 높고 결합력이 강한 capture molecule들을 개발하는 것이 필수이다. 그러나 이러한 장애에도 불구하고 protein microarray는 아주 적은 시료량으로 high-throughput assay가 가능하다는 장점 때문에 현재의 생명과학의 발전 추세로 볼 때 앞으로 protein microarray가 조만간 실용화될 것이며 이의 시장성은 매우 클 것으로 기대된다. 보다 빠른 실용화를 위해 서는 protein microarray의 개발에 필요한 기반 기술의 개발과 동시에 이를 활용하기 위한 contents의 개발도 절실히 요구된다.

Analysis of protein interactions/functions in a microarray format has been of great potential in drug discovery, diagnostics, and cell biology, because it is amenable to large-scale and high-throughput biological assays in a rapid and economical way. In recent years, the protein microarray have broaden their utility towards the global analysis of protein interactions on a proteome scale, the functional activity analysis based on protein interactions and post-translational modifications (PTMs), and the discovery of biomarkers through profiling of protein expression between sample and reference pool. As a promising tool for proteomics, the protein microarray technology has advanced outstandingly over the past decade in terms of surface chemistry, acquisition of relevant proteins on a proteomic level, and detection methods. In this article, we briefly describe various techniques for development of protein microarray, and introduce developmental state of protein microarray and its applications.

전자코는 비특정센서를 이용하여 향기성분을 검출하는 분석 장치로 칼럼의 교체나 별도의 전처리과정 없이 사람의 코와 마찬가지로 패턴을 인식하여 신속하게 향기를 분석하거나 이취여부를 판별해 준다. 다변량 통계에 의한 차별성을 토대로 향기성분의 특성간의 차이를 주로 판별할 수도 있고 인공신경망을 통하여 반복된 학습 과정을 통해 미지의 시료의 향기성분과 비교하여 판별할 수도 있다. 전자코는 된장, 치즈, 포도주 등의 발효공정 과정에서 발효정도를 예측할 수 있으며 또 다른 미생물의 오염 여부를 판단할 수가 있다. 식품산업에서 많이 활용되어 왔던 전자코 시스템의 응용은 바이오테크놀로지의 다양한 분야에도 보다 폭넓게 활용되어지기를 기대하여 본다.

It's not easy to detect the specific compounds from various compounds that fermented in bioreactor. The electronic nose was an instrument, which comprised of an array of electronic chemical sensors with partial specificity and an appropriate pattern recognition system, capable of recognizing simple or complex volatiles. It can conduct fast analysis and provide simple and straightforward results and is best suited for quality control and process monitoring in field of biotechnology. This review examined the application of electronic nose in biotechnology and brief explanation of its principle. In this minireview numbers of applications of an electronic nose in biotechnology include monitoring fermentation process, to overcome interference with alcohol, and to detect contaminant microorganism were discussed. The electronic nose would be useful for a wide variety of biotechnology when correlating analytical instrumental data with the obtained data from electronic nose.

양친성의 성질을 가진 폴리디아세틸렌 단량체를 이용한 센서는 주로 수용액 상태에서 리포좀이나 또는 다른 구조를 이용하였다. 폴리디아세틸렌은 수용액 상에서 쉽게 구조를 형성하는 장점과 여러 광학적인 특성을 가지고 있어서 다양한 목적물질의 검출을 가능하게 하였다. 디아세틸렌 단량체는 수 nm의 크기의 분자로서 LB 필름 제조 방법을 이용하면 아주 얇은 단분자층 또는 다분자층으로 필름을 형성할 수 있게 된다. 이렇게 형성된 필름은 수용액상에서 만들어진 구조체와 같은 성질을 가진다. 즉 무색으로 형성된 구조체들은 254 nm에 조사를 시키면 파란색으로 변하게 되며 650 nm 부근에서 최대 흡수 파장을 가지게 된다. 파란색으로 형성된 구조체는 다양한 외부환경(온도, pH, 용매 등)이나 목적물질 (바이러스, 단백질, 항체, DNA, 펩타이드 등)의 결합으로 약하게는 보라색에서 강하게는 붉은색으로 변하게 된다. 색전이가 이루어진 수용액이나 필름에서는 파란색에서는 존재하지 않던 형광이 630nm 부근에서 최대 방출 파장이 나타나기도 한다. 따라서 가시적인 방법이나 형광 검출 방법을 이용하면 색이 변한 정도에 따라 특이성의 정도를 결정할 수 있는 좋은 센서기술이 될 것으로 사료된다. 목적 물질 검출에 대한 연구 이외에 대부분의 폴리디아세틸렌은 색전이가 이루어진 후 가역적인 현상을 보이지 않는다. 그러나 적절하게 치환된 관능기는 가역적인 성질을 부여하게 된다. 이런 성질들을 내포하면서 막대 모양과 같은 견고한 실리카 구조체의 형성에 적용할 수 있다는 연구 결과가 보고되고 있다. 그러나 구조체를 형성하는 단량체는 비특이적인 결합을 할 수 있는 관능기 (-COOH, -NH2 등)을 포함하고 있기 때문에 선택적인 센서의 개발을 위해서는 개선해야 할 부분이다. 결론적으로 보완된 다양한 구조체와 센서 적용 기술은 현재의 표지방식을 기반으로 하는 감지 기술을 대체할 수 있는 새로운 비표지 센서로의 적용이 가능할 것으로 여겨진다.

Polydiacetylene(PDA)-based sensors possess a number of properties that can be successfully applied for label-free detection system. PDA is one of the most attractive color-generating materials, with growing applications as sensors. Here we introduce various PDA-based devices, used as biosensor, chemosensor, thermosensor, and optoelectronics sensor. In general, PDA liposomes and films are closely packed and properly designed for polymerization via 1,4-addition reaction to form an ene-yne alternating polymer chain. PDA-based two/three dimensional structures have been used for colorimetric or fluorescent devices, sensing biological as well as chemical components. This color-generating material also present a very high charge carrier mobility, allowing its application as field-effect transistor (FET). The immobilized PDA structures or films have distinct advantages for the detection of low concentration target molecules over the aqueous solution-based detection systems. In the present review, reported detection methods by using various PDA structures are summarized with updated references.

지금까지 우리는 몇 가지 나노입자에 대한 박테리아를 이용한 독성평가 및 탐지 연구 사례를 보았다. 이들은 주로 세포의 생장과 관련하여, 그 평가가 이루어졌고, silver nanoparticles과 같이 그 메커니즘을 밝히기 위해 좀 더 진행이 된 것 또한 있었다. 그러나 아직 그 연구 수준은 매우 미비한 상태이다. 위에서 살펴 본 대부분의 나노입자의 경우 산화적 손상과 밀접한 관련이 있어 보인다. 이것은 나노입자로부터 발생할 이온들에 의해 혹은 나노입자가 박테리아와 작용하여 세포막표면에 직접 달라붙는 현상들에 의해, 일어나는 것이 아닌가 하는 생각을 하게 한다. 그리고 이러한 결과들을 통하여, 나노입자의 독성 경로를 어느 정도 예측할 수 있을 것이다 확실히 밝혀내지 못한 이러한 독성 경로에 대한 연구가 더 활발히 진행되어야 할 것이다. 나노물질의 많은 장점으로 인하여, 이미 많은 항균성 나노물질이 생산되어 이용되었지만 앞으로 새롭게 합성될 숫자는 우리가 예상할 수 없을 만큼 늘어날 것이라고 생각한다. 그리고 우리는 이들의 무분별한 사용으로 인한 부작용에 다시 한번 놀라게 될 것이고, 그들의 독성에 대해서 걱정할 것이다. 우리는 이들 나노물질에 대해서 단순한 세포 생장 연구를 벗어나, 그 독성 메커니즘을 밝히는 연구 또한 동시에 진행해야 할 것이다. 그것은 동물이나 사람세포의 독성경로 파악에도 유용한 정보를 제공할 수 있 고, 나노물질의 이용으로 인한 폐해를 막을 수 있는 중요한 방법이 될 수 있는 것이다.

Nanomaterials have been applied to various fields due to their advantageous characteristics such as high surface area, rapid diffusion, high specific surface areas, reactivity in liquid or gas phase, and a size close to biomacromolecules. Up to date, increased manufacturing and frequently use of the materials, however, revoke people’s concerns on their hazard impact including toxicity the materials. Many research groups have carried out different protocols to evaluate toxic effects of nanomaterilas on different organisms, and consequently, nanomaterials are known to cytotoxicity. In this paper, we reviewed some of the most reports on toxic effects of several nanoparticles specifically on bacteria. There are numbers of reports focused on antibacterial effect of nanoparticles based on bacterial cell viability. Therefore, the application of each nanomaterial should be concerned with its toxicity and its toxic effect should be evaluated in terms of concentrations and sizes of the nanomaterials used, prior to use of a nanomaterial.

QDs을 기반으로 하는 OsFIA는 매우 빠르고 간단히 수행될 수 있다. 또한 이 분석법은 고체상의 담체나 결합/잔류시약의 분리 등과 같은 여러 과정을 필요로 하지 않으며, 적은 양의 시약으로도 분석이 가능하다. 본 분석법은 높은 감도로 항원을 측정할 수 있으며, 일상적인 분석에도 쉽게 도입될 수 있을 것이다. 선형 범위 내에서 측정 가능한 receptor의 최소농도는 0.05 nM (2.65 ng/mL) 정도이다. 또한, 일반적으로 상용화된 항체를 가지고 수행이 가능하다. 이 OsFIA 분석법은 기존의 실험적 sandwich immunoassay의 효과적인 대안으로 제시된다.

We have developed a sensitive, one-step, homogeneous open sandwich fluoroimmunoassay (OsFIA) based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) and luminescent semiconductor quantum dots (QDs). In this FRET assay, estrogen receptor-β (ER-β) antigen was incubated with QD-labeled anti-ER-β monoclonal antibody and AF (Alexa Fluoro)-labeled anti-ER polyclonal antibody for 30 minutes, followed by FRET measurement. The dye separation distance was estimated to be between 80~90 Å. The present method is rapid, simple and highly sensitive, and did not require the bound/free reagent separation steps and solid-phase carriers. A concentration as low as 0.05 nM (2.65 ng/ml) receptor was detected with linearity (R2 > 0.990). In addition, the assay was performed with commercial antibodies. This assay provides a convenient alternative to conventional, laborious sandwich immunoassays.

본 연구에서는 나노임프린트 리소그래피를 이용하여 500 nm line, 600 nm pore, 1 μm pore, 2.5 μm pore의 마이크로 수준에서 나노 수준에 이르는 다양한 크기와 모양의 nanopore 형태 패턴을 제작하였다. Thermal imprint 방식과 달리 상온, 저압에서 임프린팅이 가능하며 사용되는 스탬프의 수명을 늘리고 보다 미세하고 복잡한 형태의 패턴을 제작할 수 있는 UV-assisted imprint 방식을 사용하였다. E-beam lithography로 패턴을 각인한 quartz소재의 스탬프를 사용하였으며 스탬프의 재질이 투명하여 UV 조사시 UV curable resin이 경화될 수 있도록 하였다. 또한 스탬프의 표면을 (heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl) trichlorosilane의 monolayer 층으로 미리 코팅하여 임프린트 후 스탬프와 기판과의 releasing을 쉽게함과 동시에 패턴의 일부가 스탬프에 묻어 나와 전사된 패턴에 defect가 없도록 하였다. 또한, gold를 미리 증착하여 임프린팅함으로써 lift-off 시에 필요한 bi-layer 층이 필요 없게 되어 산소 플라즈마를 이용한 에칭이 더욱 쉽고 lift-off 공정이 생략될 수 있도록 하였다. 나노임프린트 공정에 있어 가장 큰 문제점은 잔여층의 생성이며 이러한 잔여층을 제거하고자 산소 플라즈마 에칭을 하였다. 에칭공정을 통해 gold의 표면이 완전히 드러났으며 산소 플라즈마를 통해 gold의 표면이 친수성으로 바뀌어 추후 단백질 고정화를 더욱 쉽게 하였다. 그리하여 나노임프린트 기술을 이용해 나노크기의 바이오소자 제작을 가능하게 하였다.

A constant desire has been to fabricate nanopatterns for biochip and the Ultraviolet-nano imprint lithography (UV-NIL) is promising technology especially compared with thermal type in view of cost effectiveness. By using this method, nano-scale to micro-scale structures also called nanopore structures can be fabricated on large scale gold plate at normal conditions such as room temperature or low pressure which is not possible in thermal type lithography. One of the most important methods in fabricating biochips, immobilizing, was processed successfully by using this technology. That means immobilizing proteins only on the nanopore structures based on gold, not on hardened resin by UV is now possible by utilizing this method. So this selective nano-patterning process of protein can be useful method fabricating nanoscale protein chip.

본 연구는 3-전극계와 전기화학적 활성미생물 (EAB)을 이용한 BOD 측정용 바이오센서의 개발에 대한 것이다. 바이오센서의 측정능력 조사를 위하여, 인공폐수 및 실제폐수가 사용되었다. 폐수 시료의 유입조건은 유입속도 2mL/min, 유입시간 10분, 유입간격은 50분으로 설정하였고, EAB의 전자수용체로 정전압이 적용된 작업전극을 사용하였으며 이때, 정전압기 (potentiostat)를 이용하여 +0.7 V를 인가하여 주었다. 인공폐수와 실제폐수를 이용한 BOD 측정의 정확성 분석결과, BOD 변화에 대해 발생전류 역시 비례적으로 변화하는 것을 확인하였으며 각각 0.99 및 0.98의 높은 상관계수 (BOD vs. Coulombic yield, BOD5 vs. Coulombic yield)를 가지는 것을 확인하였다. BOD (혹은 BOD5) 변화에 대한 반응시간은 30분 이내로 확인되어 실시간 측정에 적합함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들을 토대로 EAB 및 3-전극계를 이용한 폐수의 BOD 측정용 센서의 구성이 가능함을 확인하였다.

A biosensor using electrochemically-active bacteria (EAB) enriched in three-electrode electrochemical cell, was developed for the determination of biochemical oxygen demand (BOD) in wastewater. In the electrochemical cell, the positively poised working electrode with applying a potential of 0.7 V was used as an electron acceptor for the EAB. The experimental results using artificial and raw wastewater showed that the current pattern generated by the biosensor and its Coulombic yield were proportional to the concentration of organic matter in wastewater. The correlation coefficients of BOD vs Coulombic yield and BOD5 vs Coulombic yield were 0.99 and 0.98, respectively. These results indicate that the biosensor enriched with the EAB capable of transferring electrons directly toward the electrode can be utilized as a water-quality monitoring system due to a quick and accurate response.

관상심장질환 바이오마커의 하나인 CRP를 batch형 수정진동자 면역센서에 의하여 다음과 같이 분석하였다. 센서시스템의 작동은 직접결합방식에 의하여 행하였으며 CRP에 대한 항체의 최적 고정화농도는 50 μg/ml이었다. 시스템의 반응완충용액으로 0.1 M 인산완충용액 (pH 7.0)을 사용하였고 시스템 작동은 baseline 안정화, 시료첨가 및 측정, 10 mM NaOH에 의한 센서 칩 재생의 순으로 행하였다. 이중로그척도로 표시하였을 때 0.27-106.00 nM 범위의 쥐 유래 CRP에 대하여 센서반응과 직선상의 관계를 이루었으며 센서의 검출한계는 0.53 nM이었고 재사용성도 양호하였다.

A prognostic indicator of coronary heart disease, C-reactive protein, was tried to be determined by a batch-type quartz crystal microbalance immunosensor. The sensor was operated by direct-binding mode and the optimum concentration for the corresponding antibody for immobilization was 50 μg/ml. The reaction buffer for the system was 0.1 M sodium phosphate (pH 7.0) and system operation was performed in the order of baseline stabilization, analyte addition and measurement, and regeneration of the sensor chip with 10 mM NaOH. When plotted in double-logarithmic scale, the sensor showed a linear detection range of 0.27-106.00 nM for rat C-reactive protein with the limit of detection of 0.53 nM. It also showed a good reusability.