Earticle

p53은 대표적인 암 억제 유전자로서, 60% 이상의 암 조직 에 돌연변이로 존재하고 있으며(1-4), p53은 ‘Guardian of genome’ 이라고 불리는 것처럼(5), 유전자의 변형이나 파괴 에 민감하게 반응하여 세포 주기를 중단시키거나(6, 7), 세포 자살을 일으키게 하는 역할을 한다(8-9). 더불어 telomere shortening에 의한 세포노화를 촉진시키며(10, 11), 영양분 결핍 시에 나타나는 autophagy 현상을 촉진시킬 수 있는(12) 등, 수많은 세포 내의 기능이 보고되고 있는 중요한 단백질 중 하나이다. 이러한 p53의 기능은 대부분 전사인자로써 다양한 단백질의 발현을 촉진하거나 억제하며(13-16), 과다 발현 시 세포사멸을 유도하는 단백질들의 발현을 돕거나 (17, 18), 스트레스 시에 직접 세포질이나 마이토콘드리아 (mitochondria)에서 Bcl-2 family와 결합하여 마이토콘드리아의 붕괴를 촉진하여 세포 사멸을 일으킬 수 있다고 보고되고 있다(19). p53의 이러한 특성 탓에 정상적인 세포 내에서는 p53이 대단히 낮은 농도로 관찰되는데, 이는 전사 단계와 후전사 단계에서 이루어지는 많은 조절 기전이 관여 하기 때문이다. 특히 유비퀴틴화 (ubiquitination)는 가장 대표적인 단백질의 분해 기전 중 하나로써(20), 다양한 기 전을 통해 p53 단백질을 조절할 수 있다는 보고가 활발히 이루어지고 있다. 유비퀴틴 (ubiquitin)은 76개의 아미노산으로 구성되어 있는 작은 단백질로서 세포내 여러 기관이나 세포질에서 흔히 발견되며, 단백질에 결합함으로 표지화시켜 단백질 이 새로운 기능을 획득하게 된다. 유비퀴틴화는 세 가지의 효소가 관여 하는데 E1 단백질인 유비퀴틴 활성화 효소 (ubiquitin-activating enzyme)로 유비퀴틴을 활성화시키며, E2 단백질인 유비퀴틴 결합 효소 (ubiquitin-conjugating enzyme)는 E3 단백질에게 유비퀴틴을 인도하거나 스스로 목적 단백질에 유비퀴틴을 붙이는 역할을 한다. 마지막으로, E3 단백질인 유비퀴틴 접합 효소 단백질 (ubiquitin ligase enzyme, 혹은 E3 ligase)은 E2 단백질의 유비퀴틴을 목적 단백질에 접합시키는 역할을 한다(21). E3 ligase는 목적 단백질에 유비퀴틴을 접합시키므로 목적 단백질에 대한 특이 성이 있으며, 구조에 따라서 HECT domain 타입과 RINGfinger domain 타입 등으로 나뉜다. 유비퀴틴화된 단백질은 26S proteasome의 capping 단백질에 의해 유비퀴틴 사슬 (ubiquitin chain)이 인지되어 proteasome안으로 들어가서 분해되며, 이것은 기본적인 단백질의 분해 과정 중 하나이 다(22). 이 밖에도 단백질의 유비퀴틴화는 단백질의 위치 변화 및 기타 현상에 영향을 주며, 이로 인해 세포주기 조절이나 단백질의 발현 조절 등 많은 영역에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(23-25). p53의 유비퀴 틴화에 의한 분해 기전은 유비퀴틴화 기전을 통한 단백질 의 분해 기전의 대표적인 모델일 뿐 아니라, negative feed back loop를 통한 단백질의 자가 조절 기전으로서도 잘 알려져 있다. 최근에는 p53의 유비퀴틴화를 통한 분해 기전 뿐 아니라 여러 다른 기전이 보고되고 있어, 본 논문에서 는 p53의 조절 기전 중 유비퀴틴화에 의한 다양한 기전에 초점을 맞추어 요약하였다.

p53 undergoes various post-translational modifications, including phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, acetylation, methylation, and poly(ADP-ribosyl)ation. Modification of p53 widely affects to various functions of p53. Acetylation and phosphorylation of p53 have been studied for regulating its transcriptional activity which is observed in various stress condition. Otherwise, ubiquitination of p53 by Mdm2 has been well-studied as a canonical ubiquitin-mediated proteasomal degradation pathway. Moreover several investigators have recently reported that ubiquitination of p53 modulates not only its proteasome-dependent degradation by poly-ubiquitination but also its localization and transcriptional activity by mono-ubiquitination which usually does not serve the proteasome dependent degradation. Here we review recent studies on the cellular functions of p53 regulated by post-translational modifications, particularly focusing on mechanisms of ubiquitination.

농작물 수확에 있어서 농부들은 병충해를 방지하고 최대 한 많은 양을 수확하기 위해 살균제, 제초제, 살충제와 같은 여러 가지 유기 독성 화합물들을 일정한 틀 없이 무작위로 사용하는 경우가 많다. ‘농약’이라 함은 수목 및 농림산물을 포함한 모든 농작물을 해하는 벌레, 균류, 세균, 바이러스, 잡초, 선충류, 설치류를 비롯하여 여러 해충으로 인한 피해를 방지하기 위하여 사용되는 화학물질, 합성물질 또는 천연 물질로서 살균제, 제초제, 살충제와 농작물의 생리기능을 증진 또는 억제하는데 사용되는 생장조절제 및 약효를 증진시 키는 성분을 가리키는 용어이다(1). 전 세계적으로 1,200가 지 이상의 화학물질이 농약으로 등록되어 있고 매년 대략 250 만 톤이 살포되고 있으며, 땅 속의 잔류농약은 공기, 물, 그리고 토양을 통해 먹이사슬에 들어갈 것이다. 그리고 이것은 생태계, 조류, 포유류 뿐 만아니라 인류에게도 여러 건강상의 문제를 일으키는 원인이 된다. 농약은 만성적으로 암이나 유전병을 유발할 수 있으며, 골수병, 불임, 정신 분열, 면역질환, 호흡기 질환을 발생시킬 수도 있다. 또한, 다량 노출될 경우 동공축소, 구토, 근육강직, 현기증, 경련, 혼수 등과 더 심한 경우 사망에 이를 수도 있다. 미국과 유럽의 경우, 이러한 문제에 대처하기 위해 새로운 법령을 적용하고 있다. 이 법령의 시행은 인간의 건강과 생태계에 좋지 않 은 영향을 주는 물질의 존재를 감시하기 위한 확실한 환경 모니터링이 반드시 수반되어야 한다. 인간에게 물속에 존재 하는 다른 여러 종류의 농약에 대한 허용치는 농작물의 종류에 따라 다소 차이가 있긴 하지만 0.01～50.0 ppm이 다(2). 농약은 화학구조 또는 용도에 따라 몇 가지 종류로 분류할 수 있으며 이들의 화학적 특성은 곧 건강영향의 특성 과 관련되어 있다. 지난 20년간 유기염소계 살충제 (aldrin, DDT, lindane 등)들은 환경에서 지속성이 낮게 영향을 주는 유기인계화합물 (malation, paraoxon, parathion 등)과 카바 메이트계 (aldicarb, carbaryl 등) 살충제들로 교체되어 왔지 만 이들은 높은 독성 때문에 심각한 위험성을 보이며 특히 농약 살포시 주변 토양 및 수질에 영향을 미쳐서 주변환경 의 오염이 더욱 심각한 것으로 나타났다(3). 농약의 분석을 위해 일반적으로 기체크로마토그래피 (GC), 고압액체크로마토그래피 (HPLC), 또는 GC/MS, LC/MS와 ELISA 방법 등이 있다(4, 5). 이들은 고감도의 신뢰성이 있 는 정확한 분석 방법이지만 고가의 장비와 전문적인 인력 이 필요하다는 단점을 가지고 있다. 또한 시간이 오래 걸리 고 복잡한 과정을 거치는 분석방법이기 때문에 현장 측정에 적합하지 않다. 그래서 농약의 분석을 위해 간단하고 편리 한 대안으로 바이오센서 시스템을 사용하고자 하는 것이 다. 바이오센서는 측정 가능한 신호를 얻기 위해 생물학적 성분 (효소, 전세포, 항체 등)과 전기적인 요소가 접목되어 있어서 강력한 크로마토그래피 분석방법들과 필적하지 않더 라도, 이들은 빠르고 신뢰할 수 있는 분석을 제공할 수 있다. 이 장치들은 고가 장비를 사용하기 전에 사전 스크리닝에 아주 유용하게 이용될 수 있다. 지난 약 30년 간, 효소, 전 세포, 항체 등을 사용하여 여러 가지 저렴하고 신속하게 농약검출이 가능한 바이오센서가 개발되어 왔다. 본 총설에 서는 농약검출용 바이오센서의 다양한 양상을 살펴보고 주요 특징들을 서술하고자 한다. 가장 많은 연구가 진행된 효소로서 acetylcholinesterase (AChE)는 대부분의 살충농약 검출용 바이오센서로 사용 되어져 왔다. 1950년대 초반에 농약 검출을 위해서 전위 차계 검출방법이 채택되었고, 1980년대 중반에는 AChE의 저해작용에 기반한 농약 검출용 바이오센서의 구조가 처음 으로 사용되었다. 이후 과학 기술의 급격한 변화는 유전자 조작이 이루어진 새로운 AChE를 도입하게 되었고 다른 효소들 또한 바이오센서의 개발에 사용되었다. AChE 반응 에서 발생하는 전류측정 방식 바이오센서의 주요 결점은 높은 전압을 필요로 한다는 것이다. 이것은 효소에 의한 생성물, choline의 산화반응, 그리고 바이오센서의 안정성을 감소시키는 원인이 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 tetracyanoquinodimethane(6)와 같은 mediator 및 탄소 전 극(7) 혹은 탄소나노튜브 (carbon nanotube; CNT)(8)와 같은 높은 전도성을 갖는 물질이 사용되어 졌다. 효소의 정제과정 을 피하고 비용을 줄이기 위해서 전세포가 변환기 (transducer) 표면에 직접 결합되기도 했다. 효소에 대한 저해작용을 기반 으로 한 농약 측정의 주요한 한계는 비선택성이다. 살충농약 검출 바이오센서의 선택성을 개선하기 위하여, 항체가 인식 수용체 역할을 하는 immunosensor가 도입되었다. 바이오센서 의 분석 효율을 개선하기 위해 potentiometry, amperometry, differential pulse voltammetry, piezoelectry, chemiluminescence, fluorescence, surface plasmon resonance (SPR) 등과 같은 여러 검출 방법들이 바이오센서 및 immunosensor와 결합 되어졌다(9, 10). 바이오센서로서의 선택성과 생촉매로서의 안정성은 주로 생촉매를 변환기의 표면에 결합시키는 고정 화 방법에 의해 제어되었다. 공유 결합 및 흡착과 같은 여러 고정화 방법들이 발전되어 왔으며, microfabrication 기술의 진보적 발전은 실제 샘플에서 농약 모니터링을 위하여 휴대 가 간편하며, 조작이 쉽고, 값이 저렴한 환경 친화적인 바이 오센서 칩과 스트립의 설계를 가능하게 했다. 살충농약 검출 바이오센서 기술이 극적으로 발전해 감에도 불구하고, 이것 의 상품화는 아직도 걸음마 단계이며 이를 위해 더 많은 연구가 필요한 실정이다. 살충농약 검출 바이오센서는 농업, 식품산업, 의료분야 에서도 아주 유용하다고 할 수 있다. 식품의 수출입업무에 서, 빠른 응답을 갖는 휴대용 바이오센서나 키트는 신속한 검출에 상당히 편리하게 활용될 수 있고, 만약 바이오센서 가 임상용 샘플 안에 존재하는 농약이나 독성물질을 선택 적으로 검출할 수 있는 능력을 가지고 있다면, 의료 분야 에서 진단과 치료를 위해 상당히 큰 이점을 가지고 활용 될 것이다. 소형화된 센서 스트립이나 키트는 상당히 편리 하게 적용될 수 있을 것이며, 특히, 생산단계에서의 품질 모니터링, 유통단계에서의 유통관리 및 판매자의 홍보, 그 리고 일반 가정에서 매일 사용하는 수질 및 농수산 식품 의 확인을 위한 수단으로 적용이 가능할 것이다. 또한 잔 류농약 검출을 관할하는 정부기관 및 유통센터에서의 간 단한 현장 검사에도 활용될 수 있을 것이다.

In the recent years, some organic toxic chemicals were used for obtaining high-yield productivity in agriculture. The undegraded pesticides may remain in the agricultural foods through atmosphere, water, and soil and cause public health problems to environmental resources and human beings even at very low concentrations. Small amounts of pesticides can affect a central nervous system, resulting in immunogenic diseases, infertility problems, respiratory diseases and born marrow diseases, which can lead even to death. Monitoring of the environmental pesticide is one of the important issues for the human well-being. Several kinds of biosensors have been successfully applied to the detection of agrichemical toxicity. Also, few platforms for biocide detection have been definitely developed for the degradation and reaction of pesticides. Biochip and electrochemistry experiments involve immobilizing a receptor molecule on a solid substrate surface, and monitoring its interaction with an analyte in a sample solution. Furthermore, nanotechnology can be applied to make high-throughput analyses that are smaller, faster and sensitive than conventional assays. Some nanomaterials or nanofabricated surfaces can be coupled to biomolecules and used in antibody-based assays and enzymatic methods for pesticide residues. The operation procedure has become more convenient as it does not require labeling procedure. In this paper, we review the recent advances in agrichemical detection research and also describe the label-free biosensor for pesticides using various useful detection methods.

미국 FDA 규정에 의하면 라세믹 혼합물 형태의 신약은 광학이성질체 각각에 대하여 개별적인 임상결과를 요구하고 있어, 제약업체들은 신약 개발 초기단계부터 순수한 광학 이성질체로 개발하고 있다(1). 따라서 광학활성 의약품 합성 에 필요한 광학활성 화합물 및 중간체 (chiral chemicals and intermediates)의 중요성이 동시에 부각되고 있다(2, 3). 광학활성 화합물 및 중간체 관련 세계시장 동향을 살펴 보면, 미국 Drug & Market Development Publications사의 2003년 4월 공개 자료에 의하면, 미국 시장은 연평균 10.8% 의 높은 성장률로 2007년에는 27억불 규모를 형성할 것으 로 전망하고 있다(4). 영국 Frost & Sullivan사 자료에 의하면, 광학활성 화합물 및 중간체 관련 세계시장은 2000년 66.3억불에서 13.2%의 연평균 성장률로 2007년에는 160억 불로 확대될 것으로 예상하고 있다(5). 미국 Freedonia사 자료에 의하면, contract manufacturing을 포함한 광학활성 화합물의 미국 시장은 연평균 9.4%로 성장하고 있어 2005년 에는 151억불 규모가 된 것으로 추정하고 있다(6). 광학활성 styrene oxide를 포함한 에폭사이드 중간체는 반응성이 우수하고, 친전자성반응, 친핵성반응, 산․염기반응, 산화․환원반응 등 다양한 반응을 유도할 수 있어 광학활성 의약품 합성용 중간체로 널리 사용될 수 있다(7). 광학활성 styrene oxide 등의 에폭사이드는 기관지 확장제, 비만치료 제, N-methyl-D-aspartate 수용체 길항제, 살선충제, 항암제 등 다양한 광학활성 의약품 합성에 사용 될 수 있다(8). 생촉매를 이용하여 광학활성 에폭사이드를 제조하는 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째 방법은 라세 믹 에폭사이드 기질의 특정 이성질체에 대한 입체선택적 가수분해활성이 있는 epoxide hydrolase (EH)를 이용한 입체선택적 분할을 통해 광학활성 에폭사이드를 제조할 수 있다(9, 10). 다른 방법으로는 monooxygenase (MO)를 이용하여 알켄 기질의 이중결합에 비대칭적으로 에폭사이드 링을 도입시켜 제조할 수 있다(11, 12). EH를 이용한 광학 분할법은 이론 수율이 50%로 제한된다는 단점이 있는 반면, MO를 이용한 비대칭합성법은 이론적으로 100%의 수율로 광학활성 에폭사이드를 제조할 수 있다는 장점이 있다. 본 논문에서는 미생물 MO 계열인 styrene monooxygenase (SMO)를 생촉매로 이용하여 의약품 합성 중간체로 사용 되는 광학활성 styrene oxide 유도체를 제조하는 기술개발 동향을 분석하고자 하였다. 또한 다양한 광학활성 에폭사 이드 제조에 활용할 수 있는 상업적 생촉매로써의 SMO의 가능성을 평가하였다.

Enantiopure styrene oxide derivatives are versatile building blocks for the synthesis of enantiopure pharmaceuticals. Styrene monooxygenase (SMO) catalyzes an asymmetric addition of an oxygen atom into a double bond of vinylaromatic compounds. SMO is a commercially potential biocatalyst to synthesize a variety of enantiopure epoxides with high enantiopurity and recovery yield. In this paper, development of SMO biocatalyst and commercial feasibility of SMO-catalyzed asymmetric synthesis of enantiopure styrene oxide derivatives are reviewed.

Plant-made pharmaceuticals (PMPs)는 식물을 이용하여 생산되는 치료용 단백질을 일컬으며, human growth hormone fusion protein, interferon, monoclonal antibody, human serum albumin 등의 식물을 이용한 발현이 보고되었다. 식물세포 배양을 통한 치료용 단백질의 생산은 posttranslational modification (PTM)이 가능하고 분리 ·정제가 쉬우며 대규모 생산이 용이하다는 장점을 보유하고 있다(1). 이러한 형질전환된 식물세포를 이용한 치료용 단백질의 안정되고 정확한 발현을 위하여 promoter는 중요한 요소 이며, promoter에 의해 목적 단백질의 발현수준이 조절된 다. RAmy3D promoter는 벼의 종자 발아시 종자에 저장되어 있는 녹말을 분해하기 위하여 발현되는 α-amylase gene family 중 하나이며, Yu 등(2)과 Mitsunaga 등(3)은 α-amylase gene의 발현수준이 호르몬이나 당 고갈에 의해 조절되는 것을 확인하였다. 이렇듯 환경조건에 의해 조절 이 가능한 inducible promoter인 RAmy3D promoter는 총 11,519 bp로 이루어진 발현벡터 pMYN409에 hCTLA4Ig 유전자와 함께 삽입되어 재조합됨으로써 그 발현의 증가 가 보고되었다(4). 본 연구에서는 형질전환된 벼 현탁세포 를 이용한 hCTLA4Ig 생산시 당이 제거되었을 때 발현되 기 시작하는 RAmy3D promoter를 사용한 고발현 유전자 시스템을 선택하였다. Human cytotoxic T-lymphocyte antigen 4-immunoglobulin (hCTLA4Ig)은 T세포에 의한 면역반응에 관여하는 CTLA-4 (CD152)와 human IgG의 Fc 부분을 융합한 단백질이다. 그 결과, dimeric hCTLA4Ig를 형성하여 생체내에서의 반감기가 연장되었으며 또한 affinity chromatography에 의한 효과적인 정제가 가능하게 되었다(5). 면역반응 유발에 있어서 중요한 T세포의 co-stimulatory signal은 T세포 표면 의 CD28이나 CTLA-4와 antigen presenting cells (APCs) 표면의 B7 수용체 (CD80 및 CD86)간의 결합이다. 이 때, CTLA-4는 CD28과 반대로 T세포의 활성을 억제 하거나 감소시키는 신호를 전달하는 역할을 하며, B7 수용체와 약 20∼50배 높은 친화력을 보인다(Fig. 1). 따라 서 hCTLA4Ig는 T세포 특이적 면역억제 반응을 유도하여 면역억제제 역할을 한다(6). 2005년 12월 Bristol-Myers Squibb (BMS)사의 hCTLA4Ig는 자가면역질환의 일종인 류마티스 관절염 치료제로서 미국 FDA (USA Food and Drug Administration)에서 승인을 받아 Orencia® (abatacept) 라는 상품명으로 판매되고 있으며, 2008년 2분기에는 그 매출액이 1,500억 원에 이르렀다. 본 연구에서와 같이 식물세포 배양을 이용한 치료용 단백 질 생산의 경우, 세포 밖으로 분비된 목적 단백질은 여러 가지 기작에 의해 그 안정성이 낮아져 생산성에 커다란 영향을 미친다. 이런 단백질의 안정성에 영향을 미치는 요인 으로는 발현되어 배지로 분비된 단백질 자체의 구조적 특 징에 의한 불안정성이나 응집에 의한 불안정성이 있으며, 특히 배지내의 protease에 의한 목적 단백질의 분해는 생산 성에 가장 큰 영향을 미치게 된다(7). RAmy3D promoter 와 RAmy1A signal peptide를 이용한 형질전환된 벼 세포 의 경우, 당 고갈시에 목적 단백질의 발현이 강하게 이루어 지며 세포 밖의 배지로 분비된다. 하지만 이 시스템의 단점 은 당 고갈에 의해 생산이 유도되기 때문에 적절한 탄소 원이 없는 상태에서 목적 단백질을 합성하게 된다는 점이 다. 이러한 생산조건은 세포의 생존도 감소 및 사멸, 이로 인한 배지내로의 protease 분비 증가를 유발하여 목적 단백 질의 안정성 저해와 궁극적으로는 생산성 저해를 일으킨 다. 따라서 목적 단백질 안정성의 증진을 통하여 활성이 높은 완전한 생산을 유도하는 것이 필요하다. 이를 위하여, 배지의 환경조건을 조절하거나 안정제 역할을 하는 gelatin 과 같은 몇몇 gelling agent들을 첨가하여 목적 단백질의 생산성을 높이는 연구가 진행되고 있다(8). 또한 protease inhibitor를 이용하여 protease 활성을 낮춤으로써 목적 단 백질의 생산성을 높이는 연구도 보고되고 있다(9). 하지만 이러한 안정제와 protease inhibitor가 목적 단백질의 안정성 에 미치는 영향에 대한 정확한 기작을 알지 못하고, 항상 효과를 보이지는 못하고 있다. 따라서 목적 단백질 생산에 있어 보다 효과적인 첨가물질을 찾고 그 기작을 규명하기 위한 많은 연구들이 수행되어야 할 것이다. 본 연구에서는 형질전환 벼 세포배양을 이용한 hCTLA4Ig 생산에 있어서 세포의 생존도를 증진시켜 protease에 의한 단백질 분해를 낮춰줄 것으로 생각되는 첨가제인 proline 과 단백질 안정제로 알려져 있는 gelatin을 첨가함으로써 hCTLA4Ig의 생산을 증대시키고자 하였다.

Rice cells were transformed to express human cytotoxic T-lymphocyte antigen 4-immunoglobulin (hCTLA4Ig) using RAmy3D promoter. hCTLA4Ig was produced and secreted into culture media inducibly when sugar was depleted. The obstacles of this system are the cell death and release of proteases by sugar starvation. These problems resulted in the losses of stability and productivity of hCTLA4Ig. Therefore, the effects of proline as an inhibitor of cell death were investigated. When 4 mM proline was added in sugar-free media, the cell death and release of proteases were reduced. As a consequence, the production of hCTLA4Ig was enhanced. In addition, the effects of protein stabilizers such as gelling agents were studied. It was found that the application of 0.01 g/L gelatin led to an increase in hCTLA4Ig production. This increase might be originated from the stabilization of hCTLA4Ig. In conclusion, the production of hCTLA4Ig could be enhanced by the additions of proline and gelatin in transgenic rice cell cultures.

오염된 식품 섭취에 따른 식중독 발생이 전 세계적으로 증가하고 있다. 식품 매개성 질병의 일반적 원인으로 병원 성 세균을 들 수 있으며, 그 중에서도 Escherichia coli O157:H7은 식중독을 일으키는 중요한 병원체 중 하나이 다(1). E. coli O157:H7은 육류와 사과주스, 요구르트, 마 요네즈, 우유 등 다양한 식품을 매개로 하며, 물을 통해서 도 감염을 일으킬 수 있고 사람 간의 전이가 가능한 특징 을 갖는다(2). 이 균에 감염되면 용혈성 요독증후군, 출혈 성 대장염과 설사, 신장 부전, 발작 등을 유발하며 심한 경우에는 사망에 이르기도 한다(3). E. coli O157：H7에 의한 식중독 발생 건수는 미국에서만 한 해에 약 73000건에 이르며, 이 중 61 건은 사망으로 연계된 것으로 추정 된다(4). 우리나라에서도 E. coli O157：H7 감염증은 제 1군 전염병으로 지정되어 있으며 지속적으로 발병 사례가 보고되고 있어, 식중독 발생을 사전에 예방하고 원인을 파악하기 위한 신속, 정확한 탐지 시험법의 개발 필요성 은 절대적이다(5). E. coli O157：H7 탐지를 위한 보편적인 분석 방법은 선택배지에서의 배양 및 계수, 형태학적인 동정법과 생화 학적 분리 등이 있다(6). 식품 및 임상 시료와 같은 정의 되지 않은 혼합 시료에서 병원성 세균을 탐지하는 이러한 기본 분석법들은 높은 선택성과 특이성 때문에 오랜 시간 신뢰성 있는 탐지기법으로 사용되어져 왔다(7). 그러나, 이러한 기존 방법들은 전문적 기술을 가진 인력과 결과를 얻기까지 장시간이 소요된다는 단점을 가지고 있다(8). 이와같은 문제점을 해결하기 위해 면역분석법과 헥산을 이용한 분석방법이 개발되었다(9). 헥산을 이용한 미생물 탐지기술은 높은 특이성과 시료의 증폭이 가능한 장점을 가지고 있지만, 세포 추출, 헥산 정제, 증폭과 측정을 포함 한 다단계의 연속적 조작이 요구되는 단점을 가지고 있어 사용 편리성을 가지는 저가의 일회용 바이오센서로 개발 하기 어려운 한계를 가지고 있다. 면역학적 탐지 방법으로 특이적인 항원-항체 반응을 기초로 하여 병원성 미생물을 탐지하는 기술이 대안으로 개발되었으며(10), 이 방법은 헥산을 이용한 탐지기법에서 요구되는 시료 추출과 정제, 증폭의 과정없이 항원에 특이적인 결합력을 가지는 항체 를 멤브레인에 고정화하여 항원과 반응시키는 하나의 조 작만이 필요한 분석단계의 단순화가 가능한 이점을 가지 고 있다. 따라서, 복잡한 시스템이 없이 병원성 세균을 측 정할 수 있는 스트립 형태의 간단한 바이오센서의 개발을 가능하게 만든다. 전형적인 방법으로는 항원 또는 항체와 같은 특정의 분 석대상을 인식하는 분자들을 니트로 셀룰로오스 멤브레인 위에 고정화시킨 형태가 있다. 일반적인 광학 신호 발생의 경우, 발생된 신호는 육안 및 탐지기에 의해 감지 될 수 있으며, 수십분 이내의 분석소요시간을 가진다(11-13). 병 원균 탐지 분야에 면역-크로마토그래피 스트립 형태의 바 이오센서를 적용하기 위해서는, 헥산을 이용한 측정법과 는 달리 시료를 증폭하는 조작이 없기 때문에 탐지 능력 의 향상을 위해 신호 증폭 기술의 도입이 필요하다. 신호 증폭 방법으로는 효소(14), 나노입자(15), 염료 특성을 가 지는 리포솜(16) 등의 다양한 표지물질을 수용체 프로브 에 결합하여 사용하는 방법이 있다. 효소를 이용한 신호증 폭 기술인 효소면역분석법 (ELISA)은 효과적인 증폭 기 술로 면역분석법에 광범위하게 적용되고 있다. 현재 면역-크로마토그래피법에 의해 개발되어 병원성 세균 측정용으로 상용화된 키트가 몇가지 있다. Microfast E. coli O157 (Zeu-Inmunotec, Spain)은 8~18시간 증균 배양한 샘플을 이용하여 5분 이내 결과 확인이 가능하 고(2, 18), VIP for EHEC (Biocontrol system, USA)는 18시간 증균 배양 후 10분 이내의 결과 확인이 가능하 다(2, 19). Reveal for E. coli O157：H7 (Neogen, USA) 은 8~20시간 증균 배양한 샘플을 이용하여 15분 이내에 검출하고, MC Consortium (MC Consortium, USA)은 사전 증균 과정없이, 60분 이내에 검사 완료가 가능하다. 하지만 상용화되어 있는 키트들은 모두 104 CFU/mL의 검출 한계를 가지고 있다(2, 20, 21). 본 연구에서는, E. coli O157：H7 측정을 위한 방법 들 중 ELISA와 면역-크로마토그래피 분석법이 결합된 면역 스트립을 만들기 위한 제작 및 사용 조건을 최적 화하였다. 면역 스트립을 제작하기 위한 핵심 조건으로 포획항체의 농도와 탐지항체의 농도를 선정하여 최적조 건을 결정하였으며, 스트립을 사용할 때 단백질 및 미생 물의 비특이적 결합을 방지하기 위해 시료에 사용되는 첨가제의 최적 조성을 결정하였다. 결정된 최적조건 하 에서 면역 스트립을 제작하고 이를 E. coli O157：H7 검 출에 적용하였다.

In this study, the optimization of fabrication conditions was accomplished to make immuno-strip biosensor by the combination of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and immuno-chromatographic strip techniques for the detection of Escherichia coli O157：H7. Optimal fabrication conditions of capture antibody concentration, detection antibody concentration, and additive composition of running buffer solution were determined. Optimal concentration was determined as 1.0 mg/mL for both of capture antibody and detection antibody. A composition of 0.5% Tween20 and 3% BSA were selected as optimal additive for buffer solution to prevent non-specific binding.

방선균은 그람 양성 토양 미생물로서 다양한 형태적 변 형 및 생리학적 분화를 갖는 생물학적으로 매우 매력적인 미생물로 알려져 있다(1). 또한 산업적으로도 매우 유용한 항생제, 항암제, 면역억제제와 같은 다양한 2차 대사산물 을 생산하여, 인간 및 동식물의 질병 치료에도 꾸준히 사 용되어 왔다(2, 3). 최근 방선균에 대한 연구 패러다임은, 우선 신규 방선균 종 동정 및 유용 생리활성 물질을 분리 하여 그에 따른 생합성 유전자를 분리하고(4, 5), 방선균 의 전체적인 대사 조절 기작에 대한 연구결과를 접목시킴 으로써 궁극적으로는 보다 다양한 유용 신규 생리활성 물 질의 분리 및 생산성 향상을 도모하고자 하는 방향으로 진화하고 있다(6, 7). afsR2는 S. lividans 유래 조절유전자이며, actinorhodin (ACT), undecylprodigiocin (UND)의 항생제 생합성을 증가 시키는 것으로 알려져 있으며(8), S. coelicolor 조절 유전자 인 afsS와는 염기서열상 동일하며 AfsK-AfsR-AfsR2 (AfsS) two-component 시스템으로 상위 조절 기작이 비교적 잘 규명되어 있는 실정이다(9). 하지만 많은 연구에도 불구하 고 AfsR2가 어떤 기작을 통해서 항생제의 생합성 증가에 관여하는지는 아직 밝혀지지 않은 상태이다. AfsR2가 과 발현 되었을 때, pathway-specific 조절 유전자들의 발현 이 증가되는 것이 확인된 바 있으나 이것이 AfsR2의 direct-interaction에 의한 현상인지는 확인되지 않았다(10) 또한 afsR2가 존재하지 않는 외래 방선균에서 AfsR2를 발현시켰을 때 해당 방선균의 항생제 생합성이 증가한다 는 연구보고는 AfsR2가 단지 pathway-specific 조절유전 자의 발현에만 관여하는 것이 아니라 보다 많은 기능을 가지고 있음을 암시하고 있다(11, 12). 현재까지 AfsR2의 down-steam 조절기작을 규명하기 위하며 많은 연구가 진행되어 왔으며, 이전 연구에서 afsR2 염기서열 분석을 통해 3개의 α-helixes를 포함한 sigma factor의 domainⅢ에 해당하는 sigma-like 기능을 보고한 바 있으며, RNA polymerase의 결합과 관련된 sigma factor 로서의 가능성도 제시되었다(13). 또한 AfsR2 과발현 균주 를 이용하여 2D electrophoresis 연구에서는 AfsR2의 과발 현이 phosphate starvation과 관련된 단백질 발현을 촉진한 다는 결과가 보고된 바 있다(14). 특히 최근에는 S. coelicolor 유래의 afsR2 null mutant를 이용한 마이크로어레이 연구 결과, AfsR2가 phosphate starvation과 관련된 유전자들의 발현에 관여함으로써 nutritional starvation stress를 줄여 주는 것으로 예측되었고, 또한 ECF-sigma factor의 발현과 도 밀접한 관련이 있으며 하나 이상의 sigma factor가 발현 하는데 필요한 linker로서의 가능성도 제시되었다(15). 본 연구에서는 afsR2 조절유전자의 기능적 역할을 탐색 하고자 afsR2 과발현 S. lividans 균주를 이용하여 마이크 로어레이 연구를 수행하였다. 이는 기본적으로 유전자들의 발현이 저하되어 있는 S. lividans에서 afsR2의 기능을 관찰 하기 위한 적절한 방법으로 유전자들의 발현이 활성화 되 어있는 S. coelicolor의 afsS null mutant를 이용한 연구와 상호 보완적인 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단되었다. 본 연구를 통해서 AfsR2를 과발현 하였을 때, 기존에 알려진 phosphate starvation 관련 유전자들과 일부 ECF-sigma factor 들의 과발현을 재확인하였으며, 더불어 형태적 분화와 관련 있는 whi 관련 유전자와 ACT 생산과 밀접한 관련이 있는 abaA-like pleiotrophic regulatory gene의 발현과도 관련이 있음을 추가적으로 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구결과 를 토대로 afsR2가 방선균 내에서 2차 대사산물의 조절기작 및 생합성에 매우 중요한 key-factor 역할을 담당하고 있음 을 제시할 수 있었다.

AfsR2 in Streptomyces lividans, a 63-amino acid protein with limited sequence homology to Streptomyces sigma factors, has been known for a global regulatory protein stimulating multiple antibiotic biosynthetic pathways. Although the detailed regulatory mechanism of AfsK-AfsR-AfsR2 system has been well characterized, very little information about the AfsR2-dependent down-stream regulatory genes were characterized. Recently, the null mutant of afsS in S. coelicolor (the identical ortholog of afsR2) has been characterized through DNA microarray system, revealing that afsS deletion regulated several genes involved in antibiotic biosynthesis as well as phosphate-starvation. Through comparative DNA microarray analysis of afsR2-overexpressed S. lividans, here we also identify several afsR2-dependent genes involved in phosphate starvation, morphological differentiation, and antibiotic regulation in S. lividans, confirming that the AfsR2 plays an important pleiotrophic regulatory role in Streptomyces species.

최근 화석연료가 고갈되어 감에 따라 대체에너지의 필 요성이 계속적으로 증가하고 있다. 이에 따라 에너지로의 전환이 가능한 경재 (hard wood), 연재 (soft wood), 농산 부산물 (agricultural residue)를 비롯한 섬유소계 바이오매스 가 중요한 자원으로 부각되고 있다(1, 7). 섬유소계 바이오 매스는 크게 셀룰로오즈, 헤미셀룰로오즈, 리그닌으로 구성 되어있고, 셀룰로오즈는 대부분의 섬유소계 바이오매스 구성 성분의 35% 이상을 차지하는 자연계에 풍부하게 존재하는 바이오폴리머이다(2-6). 셀룰로오즈는 결정성 물질로서 일반 적으로 가수분해시켜 포도당으로 만든 후 이차적으로 사용하게 되는데, 셀룰로오즈를 에탄올로 전환하기 위한 주요 당화공정으로는 묽은 산, 농축 산 그리고 효소 가수분해법 이 있다. 셀룰로오즈는 헤미셀룰로오즈에 비해 더 가혹조건 에서 산 가수분해가 이루어지기 때문에 바이오매스의 당화 는 전처리 공정을 거쳐 헤미셀룰로오즈를 분리한 후 더 가혹 반응조건에서 셀룰로오즈 당화공정을 거쳐 에탄올 생산에 필요한 포도당을 생산하게 된다(4, 8-9). 셀룰로오즈의 산 가수분해에 의한 당화공정은 효소 당화공정보다 더 오래 된 역사를 가지고 있으며, 산 가수분해법은 1940년대 초에 이미 독일에서 사용되었다(10). 최근에는 효소를 이용한 셀룰로오즈 당화방법이 많이 이용되고 있으며 이를 위해 섬유소계 바이오매스에서 묽은 산 가수분해를 통해 헤미 셀룰로오즈를 당화시켜 분리한 후 남은 셀룰로오즈를 효소 당화 시킨다. 산 가수분해를 이용한 바이오매스의 당화는 현재에도 관심분야이고, 넓은 범위의 반응조건에 대해서 연구 되고 있다. 이러한 연구는 포도당의 미생물 발효 효율을 개선하는데 큰 영향을 미쳤다. 그 이유는 산 가수분해 시 포도당이 HMF (HydroxylMethyl Furfural)와 같은 물질로 과분해 되면서 포도당의 에탄올 발효 시 미생물의 생장을 억제하는 역할을 하기 때문에(11-13), 셀룰로오즈의 포도당 전환율을 70%이상으로 하면서 분해물 생성을 최소화하는 것을 산 가수분해에 대해 연구하는 일차적 목적으로 하게 되었기 때문이다(10). 포도당 분해물에는 크게 가역적 반응 생성물, 비가역적 반응 생성물, 그리고 구조 이성질체가 생성된다(14). 가역적 반응 생성물은 포도당의 가역적 결합․분해에 의한 이당류 와 탈수 작용에 의한 1,6-anhydroglucose가 있으며, 비가 역적 반응 생성물에는 HMF, 포름산 (formic acid), 레블린 산 (levulinic acid) 등의 미생물의 생장을 억제하는 역활을 하는 물질이 있으며 특히 HMF의 경우 일반적으로 포도당 의 이성질체인 과당 (fructose)이 분해되어 생성된다(15). 본 연구에서는 목질계 바이오매스의 묽은산 당화공정에서 부생될 수 있는 포도당의 분해물들에 대하여 조사하고, 순수 포도당과 HMF를 묽은 산으로 처리하여, 포도당 분해물들 의 생성 및 이차분해 거동에 대하여 조사하고자 하였다.

During a dilute acid hydrolysis, degradation products are formed or liberated by pre-treatment of lignocelluloses depend on both the biomass and the pretreatment conditions such as temperature, time, pressure, pH, redox conditions, and addition of catalysts. In lignocellulosic biomass,sugars can be degraded to furfural which is formed from pentoses and 5-hydroxymethulfurfural (HMF) from hexoses. 5-HMF can be further degraded, forming levulinic acid and formic acid. Acetate is liberated from hemicellulose during hydrolysis. Some decomposed compounds hinder the subsequent bioconversion of the solubilized sugars into desired products, reducing conversion yields and rates during fermentation. In the present work, samples of rapeseed strawwere hydrolyzed to study the optimal pretreatment condition by assessing yields of sugars and decomposed products obtained under different reaction conditions (H2SO4 0.5-1.25% (w/w), reaction time 0-20 min and temperature range 150-220 C). A careful analytical investigation of acid hydrolyzate of rapeseed straw has not yet been undertaken, and a well-closed mass balance for the hydrolyzate in general is necessary to verify the productivity and economic predictions for this process.

식중독은 오염된 음식물을 섭취함으로서 발생하는 구토, 설사, 복통 등의 증세를 일으키는 임상 증후군을 말한다. 해마다 국내외적으로 식중독 세균에 의한 식중독 사건이 증가하고 있는 추세이다. 미국의 경우 해마다 약 7천 6백 만 건의 식중독이 발생하고, 그로 인하여 약 5천여 명이 죽는 것으로 보고되었다(1). 과거에는 여름철에만 빈번하 게 발생하던 식중독이 점차 계절에 상관없이 발생하고 있 다. 특히 대량 급식소에서 발생하는 식중독이 커다란 문제로 대두되고 있으며, 식중독 원인균도 다양화 되어가는 추세 이다. 식중독 원인균 가운데 가장 많은 비중을 차지하는 것이 Salmonella 종이며, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio, Shigella 속의 균주들도 식중독을 일으키 는 것으로 알려져 있다. 이들 식중독 세균은 주로 육류, 채소, 난류, 우유나 유제품 그리고 조리 가공 식품 등의 여러 가지 음식물을 오염시킬 수 있으며, 이를 섭취한 사람 으로 하여금 심각한 식중독을 유발시킨다(2). 김치는 우리나라 고유의 전통 발효 식품이다. 김치의 발효 에는 젖산세균이 관여하는데, 이 젖산균에 의한 각종 암의 억제효과와 면역증강효과 등의 영양학적 가치가 인정되면 서 김치에 대한 관심이 국제적으로도 높아지고 있으며, 김치 발효에 대해 많은 연구가 진행되고 있다(3, 4). 김치 발효 과정에 관여하는 젖산균은 프로바이오틱 (probiotics)으로 알려져 있으며, 그람양성이고, 일반적으로 통성 혐기성 세 균이다. 또한 탄수화물을 발효에 의한 에너지원으로 사용 하고 최종산물로 젖산과 아세트산을 생성한다. 이들 젖산 균은 장내 상피세포에 부착하여 항균성 박테리오신, 젖산, 유기산, 과산화수소 등을 합성하여 병원균을 죽이거나 병 원균에 의한 독소 생산을 억제하고, 독소 수용체를 분해하 므로, 장내 유해 세균에 항균작용을 가진다(5-9). 최근에 김치의 발효에 관여하는 젖산 세균들이 감기에 대한 저항 력을 증진시킬 뿐만 아니라(10), 이를 배양하여 사료에 첨 가함으로서 조류인플루엔자의 조절에도 기여한다는 내용 이 보고되면서 점차 관심이 고조되고 있다(11). 본 연구에서는 김치의 발효에서 생성되는 젖산 세균을 분리하여, 여러가지 생화학적 특성 조사와 16S rRNA의 부분 염기서열 분석을 실시하였다. 또한 이 분리세균을 이 용하여 식중독을 일으키는 여러가지 병원체에 대한 항균 력을 조사하였으며, HPLC를 통하여 이 항균활성에 기여 하는 물질을 확인하였다.

The purpose of this work was to investigate the antibacterial activity of Lactobacillus plantarum YK-9 isolated from fermented Kimchi. Morphological and biochemical characteristics of L. plantarum YK-9 were examined. Phylogenetic analysis using 16S rRNA sequencing was performed to identify the strain, and the strain could be assigned to Lactobacillus plantarum, designated as L. plantarum YK-9. The strain was registered in GenBank as [FJ669130]. During the incubation period of L. plantarum YK-9, the changes of bacterial growth and residual organic acids were monitored. HPLC was used to confirm the organic acids produced in the cultures as metabolites. L. plantarum YK-9 produced both lactic acid and acetic acid, which were responsible for the pH decrease during growth. Initial pH 7.0 of the cultures decreased to 3.6 at the incubation after 72 hours, and concentrations of lactic acid and acetic acid increased to approximately 588.7 mM and 255.5 mM, respectively. The antibacterial activities against food-poisoning causing bacteria were examined with 20-fold concentrated culture supernatants from L. plantarum YK-9, and the antibacterial effects were clearly observed against all the bacteria tested in this work.

Streptomyces avermitilis는 멜라닌 같은 갈색색소 항생 제인 avermectin과 oligomycin 등을 이차대사 산물로 세포 내에 생산한다. 특히 S. avermitilis는 항 기생충 및 항 곤충 의 활성스펙트럼을 갖는 항생제인 avermectin의 유일한 생산 자이다(1). Genome은 linear form으로 9,025,608 bp로 이루어 졌고, GC content는 70.7%이며, 7,574개 이상의 open reading frame (ORF)들이 존재한다고 알려졌다. Oligomycin은 avermectin과 함께 S. avermitilis에서 생산 되는 이차대사산물 중의 하나로서 ATP-synthase와 결합 하여 ATP의 합성을 저해한다. 결국, 미토콘드리아에서 산화 적 인산화반응 (oxidative phoshorylation)을 억제하여 세포를 사멸시키므로 포유동물에 독성물질로 작용하는 반면 에 식물에 자생하는 곰팡이를 사멸하는 진균제로 사용되 기도 한다(2). Huang 등(3)이 Streptomyces sp. MA-5038 (S. avermitilis)에서 처음으로 oligomycin을 분리하였으나, 그 세포독성으로 인해 많은 연구는 이루어지지 않았다. 그러 나 S. avermitilis에서 full genome sequencing이 완료됨에 따라 oligomycin의 생합성에 관여하는 7개의 유전자 (olm) 가 거대한 cluster를 형성하고 있는 것으로 밝혀졌다(4). Oligomycin은 Fig. 1에서와 같이 두 부분의 치환기 차이에 따라 세 종류로 분류되지만 S. avermitilis에서는 oligomycin A와 oligomycin C만이 생성된다. 이와 같이 S. avermitilis 의 야생균주는 avermectin 뿐만 아니라 polyketide 유래의 oligomycin을 생산하기 때문에 avermectin의 산업적 생산 과정에서 oligomycin은 제거되어야만 하는 대사산물이다. 따라서 본 연구에서는 S. avermitilis의 oligomycin 생합성 과정에 관여하는 유전자를 knock-out 시켜 oligomycin의 생합성이 이루어지지 않도록 유도하고, S. avermitilis로부터 유용한 항생물질인 avermectin 만을 생산할 수 있는 균주 개발에 대한 연구를 수행하였다.

Streptomyces is well known for their ability to synthesize enormous varieties of antibiotics as secondary metabolites. Among them, S. avermitilis produces avermectins, a group of antiparasitic agents used in human and veterinary medicine. However, S. avermitilis also produces oligomycin, which is a potential toxic inhibitor of oxidative phosphorylation in mammalian cells. Therefore, we decided to disrupt oligomycin synthetase gene to prevent co-production of oligomycin in S. avermitilis. To create plasmid for disruption, the smallest gene of oligomycin synthetase gene cluster was obtained by PCR from S. avermitilis chromosome. Then, apramycin resistance gene was inserted in oligomycin synthetase gene for selection. After transformation of this plasmid, oligomycin synthetase gene (olmA5) in the chromosome was displaced with disruption cassette on the plasmid via homologous recombination. As a result of this gene replacement, we obtained mutants (olmA5::apra) that no longer makes the toxic oligomycin. And the mutants confirmed by PCR and HPLC analysis. However, showed no increasement of avermectin production in the mutant was observed.

최근 DNA microarray를 필두로하여 다양한 high-throughput 기술들이 개발됨에 따라서 시스템생물학 (Systems Biology) 연구가 생물공학 연구의 새로운 패러다임으로 자리잡고 있다. 시스템생물학은 genome, transcriptome, proteome, metabolome 등 다양한 level에서 생명현상을 관찰하고, 이의 복합적인 분석을 통하여 생명현상을 글로벌수준에서 이해하는 학문이다. 그리고, 이러한 생명현상에의 이해를 바탕으로 하여 생명체의 특성을 원하는 방향으로 개량하 는 일련의 연구를 시스템생물공학 (Systems Biotechnology) 이라 정의한다. 시스템생물공학연구의 효율을 높이기 위하 여는 균주의 대사반응의 변화를 분석 및 예측하는 기술의 확보가 필수적이다. 따라서, 대사회로 분석 및 대사거동 예측은 시스템생물공학연구의 핵심적인 분야로서 활발한 연구가 이루어지고 있다(1-5). 대사network는 수천 개의 유전자 및 효소반응들이 서로 연관되어있는 복잡한 네트워크 시스템이다. 대사network를 유전공학적 방법으로 조작하여 원하는 기능을 나타내도록 개량하기 위하여 대사network간의 상관관계를 명확히 파악 하는 것이 선결되어야 한다. 대사network사이의 상관관계 를 파악하지 못하고 유전자 조작을 수행하였을 경우, 기대 하던 효과를 얻지 못할 수 있을 뿐 아니라 의도하지 않았던 부작용도 일어날 수 있다(6-7). 본 연구에서는 대사network간의 기능적 연관성을 분석 하기 위하여 transcriptome 연구에 주로 활용되던 ARACNE (Algorithm for the Reconstruction of Accurate Cellular Networks) 기법이 활용되었다. ARACNE는 새롭게 개발 된 transcriptome 데이터 분석 프로그램으로서, microarray 데이터로부터 transcription 네트워크를 구축하기 위하여 활용되어지고 있다. 즉, 전체 유전자의 발현량 데이터를 분석하여 어떠한 유전자들의 발현이 서로 연관되어져 있 는지 파악하여, 유전자들 사이의 기능적 연관성을 예측하 게 하여주는 프로그램이다(8-11). 본 연구진은 64개 미생 물 균주의 유전정보를 바탕으로 각 대사network간의 상관 관계를 연구하였다.

Metabolic network is composed of more than thousands of metabolic reactions. Therefore, understanding of metabolic behavior of microorganisms is required to engineer metabolism of microorganisms. In this paper, we employed ARACNE (Algorithm for the Reconstruction of Accurate Cellular Networks) to quantify relationships among metabolic subpathways. The results showed that ARACNE analysis can give new insight into the study of bacterial metabolism.

오․폐수 중의 질소와 인 성분은 하천 및 호수의 부영 양화를 발생시키며, 바다에서는 적조의 발생을 야기하게 된다. 특히 질소를 포함한 오․폐수는 얕은 하천에서 조류 (algae)와 수생식물의 성장을 증진시켜 수자원의 사용을 제한하게 된다(1, 2). 오․폐수 중의 총질소 (T-N)는 지역 별 오염물질 총량규제의 실시와 더불어 2008년부터 폐수 종말처리시설과 공공하수처리시설의 규제가 대폭 강화되 어 법적 방류허용기준 외에 더욱 높은 제거효율을 요구하 고 있다(3, 4). 현재 개발된 오․폐수 중의 질소 고도처리 기술은 생물 학적 방법과 물리화학적 방법을 단독 또는 병합하여 실제 현장에 적용하고 있다. 처리 방법의 선택은 각 산업체에서 발생되는 오․폐수 내 오염물질의 성상과 농도에 따라 가장 효과적인 방법을 선택하고 있다(4-6). 생물학적 처리법에 의한 질소처리는 오․폐수 중의 암모늄 이온 (NH4 +)이 호기 성 상태에서 질산화 미생물에 의해 생물학적으로 질산화 (nitrification; NH4 + ⟶ NO3 -) 되었다가, 다시 무산소 상태 에서 탈질 미생물에 의해 생물학적 탈질화 (denitrification; NO3 - ⟶ N2)가 일어나 질소화합물이 질소가스로 환원됨 으로 오․폐수 중의 질소성분의 제거가 이루어진다. 오․폐 수 중의 질소 성분을 제거하기 위해서는 유출되는 오․폐수 의 성상에 따라 다르지만, 일반적으로 질산화와 탈질화가 모두 필요하다. 알려진 생물학적 질소처리 공법들은 침전조 의 수에 따라 single sludge process, dual sludge process, triple sludge process로 구분되며, 이외에도 4단 Bardenpho process 등이 있다(3-5, 7, 8). 현재 널리 쓰이고 있는 상용기술은 고농도의 산업폐수 에서 유입수의 유기물 농도가 낮은 경우 외부탄소원을 사용 하여 탈질공정을 높은 효율로 수행할 수는 있으나, 질산화 공정에서 높은 효율을 얻기가 어려워 질산화 효율이 떨어져 총질소의 제거효율이 낮은 문제가 있다(4, 7). 하수의 경우 에는 유입수량과 수질의 불규칙성 때문에 질산화 공정에서 질산화 미생물의 관리가 어려워 첨가탄소원을 사용하더라 도 질산화 공정에 문제가 발생하여 총질소 제거효율이 떨어 지는 문제가 있다(3). 본 연구에서는 기존의 하수고도처리 공법의 개선방법으로 호기조 내에 다공성 담체를 적용하였다. 다공성 담체의 적용 은 고농도 미생물의 유지가 가능하고, 생물막적 처리 뿐만 아니라 담체에 의한 여과작용 등이 복합적으로 이루어지기 때문에 우수한 처리효율을 얻을 수 있는 장점이 있다. 이는 고농도의 미생물군의 유지와 다공성 담체에 의한 여과작용 으로 유출되는 SS (suspended solid)의 양을 최소화하여 처리효율을 높여주고 기존 공정의 대규모 호기조의 폭기에 따른 소요동력비를 줄일 수 있을 것으로 기대되고 있다(9). 본 연구에서 적용한 YPNR (Youngam Phosphate & Nitrogen Removal) 고도처리 공법(Fig. 1)은 기존의 Bardenpho 공법의 단점을 보완, 개선한 공법으로서 혐기 조, 무산소조 및 호기조로 구성된 생물반응조 중 호기조 내에 고정상 미생물 담체 (질산화 여재)를 충진하여 유효 미생물량을 늘림으로써 질산화율을 극대화하고 체류시간 을 단축시키고자 하였다. 본 공정의 특징은 유기물 분해 미생물 및 질산화 미생물을 50~70%는 부유상태로 유지하 고, 30~50%는 부착 상태로 유지함으로써 인 제거시 수반 되는 슬러지의 배출에 대비하여 미생물 농도를 적정 수준 으로 유지할 수 있게 하였다. 또한, 제 1 및 제 2호기조 내 에 접촉 여재 및 산기관을 포함하는 질산화 장치를 구비 시킴으로써 슬러지 유지시간을 길게 유지하고 용존산소가 안정적으로 유지되도록 하였다(3, 10). 본 연구에서는 하수나 마을하수에 중 총질소의 고도처 리를 위하여 오·폐수의 고도처리 공법인 YPNR 공법을 하 수처리 현장에서 실증연구를 수행하여 질산화 효율 및 총 질소 제거효율에 대한 실증연구를 수행하였다.

This study performed verification experiment for the removal of total nitrogen in sewage from a Town M village sewage treatment plant using YPNR processes. The total nitrogen discharged after the denitrification process was maintained at a level of 8-15 mg/L, which results in the total nitrogen removal efficiency above 68% on average. The total nitrogen components in discharged water consisted of 16% of ammonia nitrogen, 6% of nitrite nitrogen, and 77% of nitrate nitrogen, which reaches a 95% nitrification efficiency. Hence, the YPNR advanced treatment process used in this study can be successfully applied to sewage treatment.

오․폐수 중의 질소성분은 수질오염을 발생하여 용수의 사용제한 및 부가적인 환경오염을 야기하고 있다(1). 현재 적용되고 있는 오․폐수 중의 질소 고도처리 방법은 각각 의 발생원의 오․폐수 중의 오염물질의 성상과 농도에 따라 다양한 방법을 선택하여 물리화학적 방법과 생물학적 방법 을 단독 또는 병합하여 사용하고 있다(2-4). 물리화학적 방법 으로는 breakpoint chlorination, 암모니아 stripping, 이온교환 법 등의 방법이 사용되고 있다. 생물학적 방법으로는 미생물 을 이용하여 오․폐수 중의 암모늄 이온을 호기성 상태에서 질산화 미생물을 이용하여 생물학적으로 질산화한 후, 다시 무산소 상태에서 탈질 미생물을 이용하여 생물학적 탈질 화가 일어나도록 하여 질소화합물을 질소가스로 환원시켜 질소성분을 제거하는 방법이 있다. 미생물을 사용한 오․폐 수 중의 질소 성분을 제거에는 유출되는 오․폐수의 성상과 농도에 따라 다르지만, 일반적으로 질산화와 탈질화 공정 이 모두 수행되어야 한다(2-6). 폐수 중의 질소성분은 크게 유기성 질소와 무기성 질소 로 분류하며, 무기성 질소 성분은 암모니아성 질소, 아질산 성 질소, 질산성 질소의 형태로 존재한다. 유기성 질소는 미생물에 의하여 암모니아화 과정을 거쳐 암모니아성 질소 로 전환된다. 일반적으로 암모니아화된 질소와 원폐수에 존재하는 암모니아성 질소는 폐수 중의 주요 질소 형태로 존재한다(7-9). 질산화 반응은 암모니아성 질소가 호기성 상태에서 질산 화 미생물에 의하여 아질산성 질소와 질산성 질소로 산화 되는 과정으로 암모니아 산화과정과 아질산 산화과정으로 구분된다(3, 4, 7, 8). 암모니아 산화과정 : NH4 + + 1.5O2 ⟶ NO2 - + H2O + 2H+ 아질산 산화과정 : NO2 - + 0.5O2 ⟶ 2NO3 - 일반적으로 질산화 반응은 화학합성 독립영양균에 의해 이루어지는 것으로 알려져 있으며, 암모니아성 질소에서 아질산성 질소의 형태로 산화시키는 질산화 반응에 관여 하는 미생물로는 Nitrosomanas sp., Nitrosospira briensis, Nitrosococcus nitrous, Nitrosolobus multiformis 등의 아질 산화 미생물등이 있다. 또한, 아질산에서 질산으로 산화시 키는 미생물로는 Nitrobacter sp., Nitrosospina gracilis와 Nitrosococcus mobilis 등의 질산화 미생물이 있다(3, 4, 7, 8). 질산화 미생물에 의한 암모니아성 질소의 아질산성 및 질산성 질소로의 산화는 에너지 생성반응이며, 이때 생성 되는 에너지를 이용하여 이산화탄소, 중탄산, 또는 탄산과 같은 탄소원을 동화한다. 질산화 반응은 일반적으로 호기 조건에서 잘 일어나며, 산화 과정에서 생성되는 수소이온 을 중화시키기 위해 충분한 알칼리도를 공급하여야 한다. 질산화 미생물들은 절대 호기성이지만, 호기성 종속영양 미생물보다 산소에 대한 친화력이 낮아 높은 용존산소를 요구한다(3, 4, 8, 9). 또한 환경조건에 대단히 민감하여 영향인자의 변화에 의하여 미생물의 성장과 활성이 좌우 된다. 질산화 반응의 영향인자로는 배양온도, pH, 알칼리도, 용존산소, C/N 비, 탄소원의 종류 등이 있다(5-7). 본 연구에서는 폐수처리장의 활성슬러지를 이용하여 합 성폐수를 대상으로 질산화 공정에 미치는 인자들에 대한 연구를 수행하였다.

This paper was investigated the research regarding the effects of several factors such as initial ammonium nitrogen concentration, aeration rate, biomass amount and C/N ratio on nitrification process using synthetic wastewater and activated sludge obtained from wastewater treatment facility. As a result, in high ammonium nitrogen concentration above 100 mg/L, the pH of wastewater was dropped to pH 6.8. The increases of initial ammonium nitrogen concentration, aeration rate and initial biomass amount were linearly enhanced the removal rate of ammonium nitrogen. In the condition of C/N ratio of 0 to 3, high ammonium nitrogen removal rate was obtained.

영지버섯 유래의 다당류는 점차 각종 기능성 식품소재 및 의약품 소재로의 잠재적 가능성이 매우 높은 것으로 인식되고 있으며, 산업적인 관심도 매우 고조되어 있는 실 정이다(1-4). 그러나 버섯의 자실체나 균사체 유래의 생리 활성 다당 류는 추출 공정이 복잡하고 수율이 낮기 때문에 최근에는 이들 단점을 극복할 수 있는 액체배양법에 의한 세포외 다당의 생산이 널리 시도되었고, 다당의 효율적 생산을 위 한 유망 대체수단으로 많은 관심을 받았다(5-11). 저자 등도 그동안 air-lift 또는 jar fermenter system을 이용하여 영지의 액체배양에 의한 세포외 다당 생산의 연구 를 수행하였고, 세포외 다당의 성분 및 구조규명, 배양 동력 학적 특성, 배지 및 배양 최적화, 생물활성 탐색, 균사의 형 태분석 등에 관한 각종의 연구결과를 보고하였다(12-24). 특히, 균사체 생육과 세포외 다당 생산의 최적 pH가 각각 3 및 6으로 크게 달랐으므로 초기 6시간 동안 pH 3으로 배양하다가 이후 pH 6으로 shift하여 배양하는 bi-staged pH process를 개발함으로써 세포외 다당의 생산을 크게 향상시키는 결과를 얻은 바 있다(16, 18, 23). 이들 연구 결 과에 따르면 영지 세포외 다당은 분자량 약 106 dalton의 1,6 가지를 갖는 β-1,3 glucan을 함유하는 heteropolysaccharide 로 항종양 다당 및 식유섬유로서의 성분특성을 나타내었으며, 겔화능이 우수하여 겔화제로서의 용도적성을 갖는다. 또 in vitro에 의한 생리기능의 조사결과, 포도당 및 bile acid에 의한 흡수지연효과를 나타내어 식이섬유소재로서의 혈당 및 콜레스테롤 저하식품소재로서의 가능성이 있다. 아울러, 이들 다당은 항암활성, 면역증강 기능, 세포증식 및 분화능 등을 나타내어 생리 기능성 다당소재로서의 잠재력 이 매우 높은 것으로 기대되었다. 하지만 아직도 산업적 생산 체제를 갖추기에는 미흡한 실정이어서 대량생산 공정의 개발을 위한 검토의 필요성이 높은 실정이다. 특히, 산업적 규모의 jar fermenter에 의한 발효생산은 실험실 규모 발효생산의 기질 전환율 및 생산성 과 일치하여야 하며, 이를 위해 scale up의 연구가 필요하다. Scale-up의 기준으로는 발효조 내의 전단력과 밀접한 관련을 갖는 impeller tip speed (πNDi), 단위용적당 소비 동력 (P/V) 및 Reynolds 수 (NRe) 등의 각종 인자들이 사용 된다. 일반적으로 산소요구도가 큰 호기적 미생물 발효의 scale-up에는 산소이동용량계수 (kLa)에 기준한 scale up의 방법이 가장 널리 이용된다(25, 26). 하지만 영지버섯의 액체배양에서 kLa를 기준으로 한 성공적인 scale up을 위해 서는 균체나 생성물이 전단에 영향을 받지 않는 것이 중 요하며, 따라서 이를 위한 적정 교반 및 통기조건의 확립 이 필요하다. 그러므로 본 연구에서는 영지 액체배양의 균사체 및 세 포외 다당의 대량생산을 위해 2.6, 20 및 75 L용량의 jar fermenter system을 사용하여 세포외 다당 생산의 현저한 향상이 가능하였던 bi-staged pH process(16)하의 배양을 통하여 통기 및 교반속도에 따른 용존산소 및 산소이동용량 계수 (kLa)의 변화를 조사하였다. 아울러, 이들의 상관관계 를 통계분석하여 해석함으로써 scale up의 조건을 확립하 였으며, 이로부터 영지의 액체배양에 의한 균사체 및 세포 외 다당 생산의 산업적 응용자료를 마련하고자 하였다.

A scaling up study for the exopolysaccharide (EPS) production by submerged culture of Ganoderma lucidum was carried out in jar fermenter systems (2.6, 20 and 75 L) under bi-staged pH process. Profiles of dissolved oxygen (DO) and volumetric coefficient of oxygen transfer (kLa) as a function of operating variables (agitation speed and aeration rate) was investigated, and a correlation between kLa and operating variables was analysed statistically. Under bi-staged pH process, no limitation of DO was observed at agitation speeds tested in the range of 200 and 600 rpm, and the highest EPS production was obtained at the level of DO of 40~80%. From the regression analysis, the relation between kLa, gas velocity (Vs), stirrer speed (N) and impeller diameter (Di) could be expressed as : kLa = 0.555 × Vs0.42 × (N3×Di2)0.33 (R2= 0.925, p<0.05) It was found that under 2.6 L jar fermenter, the optimum agitation speed and aeration rate was 400 rpm and 1 vvm, respectively, obtaining the EPS production of 15.43 g/L. Under the submerged cultivation of G. lucidum in jar fermenters of 2.6~75 L, the similar EPS yields at each fermenter were achieved during scaling up based on kLa, and kLa value for maximum EPS production was 85.4 ± 26.70 h-1.

최근 생명공학 기술과 의료수준의 향상으로 살아있는 세포를 이용하여 다양한 질병의 치료에 적용하는 세포치료 연구가 활발히 이루어지고 있다(1-3). 이에 따라 동물세포 의 이용성은 기존의 세포 생산물 이용 분야에서부터 세포 자체를 직접 이용하는 분야까지 그 범위가 확대되고 있다. 세포를 이용한 모든 치료 및 공정은 세포가 살아있어야 하 며 세포의 고유 기능이 유지되어 있는 상태여야 하기 때문 에 세포의 생존을 유지시키는 세포 보존기술은 세포를 이용 하는 모든 분야에서 매우 중요한 요소 기술이다. 세포는 보존과정에서 온도가 감소함에 따라 수많은 스트 레스를 받게 된다. 산화체계의 파괴로 활성산소가 생성되고, 이는 세포내에서 지질산화, DNA 및 RNA 손상, 세포골격 의 변화 등을 일으킨다. 또한 세포막의 구조나 유동성, 구성 분 등의 변화로 인해 막수용체가 활성화되고, apoptosis를 일으킬 수 있는 일련의 과정이 진행된다. 세포막의 Na+-K+ 펌프와 Ca2+ 이온 채널이 멈추면서 세포의 이온 균형이 무너지고, 이는 세포내 칼슘농도의 증가, 삼투압 차이 발생, 세포의 붕괴로 이어 진다(4-7). 저온보존에서의 세포 손상은 추가적인 스트레스 관련 반응을 유발할 수 있다. 온도가 낮아지면서 발생하는 대부 분의 반응은 세포에 손상을 일으키지만, 저온에서는 일부 세포의 생존반응이 활성화되기도 한다. 이는 세포가 스스로 스트레스를 줄이고 손상을 최소화하는 방향으로 반응하는 것을 말한다. 많은 경우에서 이러한 생존반응은 ATP와 같은 에너지를 더욱 빠르게 소비하기 때문에 결과적으로는 더 나쁜 상황이 되고, 결국에는 에너지 부족 등의 원인으로 세포사멸에 이르게 된다(8, 9). 세포나 조직의 저온보존에는 콜린스 (Collins)액, 유로콜 린스 (Euro-Collins)액, CelsiorⓇ액, HTK (CustodiolⓇ)액, UW (University of Wisconsin, ViaspanⓇ)액 등의 보존액 이 종래부터 이용되고 있으며, 현재 가장 널리 사용되고 있는 UW액은 다양한 장기 (organs)의 이식에서 주로 적용 되고 있다(10-15). 하지만 이러한 용액들도 실제 임상에서 는 장기를 24시간 이상 보존하기가 어려운 실정이다(11). 또한 장기 보존을 최적화하기 위해 설계된 용액이기 때문에 세포의 종류에 따라 보존능력이 상이하거나 그 효과가 미미 한 단점을 가진다. 따라서 최근에는 UW액에 항산화제를 비롯한 다양한 유효성분을 첨가하여 사용하는 등, 조직 및 세포 보존에 더욱 적합한 보존액이 개발되고 있다(16-18). 본 연구에서는 동물세포의 저온보존에서 우수한 보존능력 을 나타내는 유효성분을 탐색하고, 개선된 저온보존액을 개발 함으로서 보다 안정적인 세포 저온보존 기술을 제공하고자 하였다. 또한 동물세포 저온보존에 대한 향후 개발 방향을 제시하고자, 저온에 의한 세포손상 원인과 유효성분의 손상 보호효과를 평가하였다.

Stable cell preservation is an essential factor in the regenerative medicine for cell therapies and transplantation of biologic materials. In this study, we studied to provide more stable hypothermic preservation by protection of cell damage during the preservation at 4℃. The result of searching for key components that have excellent efficacy in hypothermic preservation of cells, we have identified the fact that the hypothermic preservation adding protein hydrolysates such as yeast hydrolysate is far superior to others. All protein hydrolysates that are derived from animal, plant and microbe sources have superior efficacy, especially the peptides which have molecular weights under 10 kDa have the best efficacy among the components of protein hydrolysate. The protein hydrolysates prevented the decrease of ATP level in the cells caused by hypothermic environment and they inhibited the generation of ROS. Adding antioxidants and control agents of osmotic pressure were showed to have more superior efficacy in hypothermic preservation. Finally, KUL261 solution (DMEM/F12 1：1 medium, yeastolate 1%, α-tocopherol 100 μM, dextran 2.5%), the preservation solution developed in this study, showed the best efficacy in both cell viability and cell growth more than other conventional preservation solutions. In conclusion, the improved hypothermic preservation solution that contains the protein hydrolysates as a key component provide the best preservation efficacy. It provides better efficacy than other preservation solutions and will contribute to both the development of regenerative medicine and global commercialization in this therapeutic field.

Astaxanthin (3,3`-dihydroxy-β,β-carotene-4,4`-dione)은 carotenoid 계열의 항산화 물질로서, 주로 새우, 붉은 도미류, 연어 및 바닷가재 등과 같은 해양 동물의 조직에 존재하는 것으로 알려져 있다(1, 2). Astaxanthin은 정상적인 호기적 대사과정 중 활성산소에 의한 세포벽 내 DNA, 단백질, 지질 등의 손상과 세포와 조직의 노화 및 발암을 유발하는 반응 을 억제할 뿐만 아니라, 유리 라디칼의 생성을 억제하는 작용 을 한다. Astaxanthin은 다른 carotenoid 보다 최소한 10배, α-tocopherol 보다 500배 이상의 항산화 활성을 가지고 있는 데 이는 C-4와 C-4`에 위치한 oxo- 그룹 때문이라고 보고되 어 있다. 특히 다른 많은 고등동물에서는 생합성 되지 않는 특성으로 인해 양계를 포함한 가금 산업이나, 연어, 송어 등 을 포함한 양식 사업에 있어서 색소, 풍미원 및 항산화 활성 으로 인해 중요한 첨가제 역할을 하고 있다(3). 또한 인체 내에서 vitamin A의 전구체 역할을 하며, cytokine 유도 활성으로 인한 면역기능 활성, oxygen radical의 제거에 의한 난소암, 간암 등의 예방효과 등이 입증되어 의료 및 화장품 산업에도 상당한 가치가 인정되고 있어 최근 많은 관심을 받고 있는 물질이다(4). 최근에 astaxanthin의 화학 합성법이 개발되었으나, 화학 합성으로 제조된 astaxanthin은 천연물에 비해 낮은 생체 흡수율을 보임에 따라, 천연 astaxanthin의 생산에 상업적 관심이 일고 있다. 현재 astaxanthin을 생성하는 균주로는 효모인 Phaffia rhodozyma(5), 녹색조류인 Haematococcus pluvialis(6), gram-positive 박테리아인 Brevundimonas sp.(7), 그리고 gram-negative인 Paracoccus sp.(8, 9) 등이 알려져 있다. 이중에서 Paracoccus sp.는 gram 음성균의 해양미생물로서, 최근 astaxanthin 생합성 유전자가 분리되어졌다. Paracoccus 를 이용한 astaxanthin의 생산은 연어 등의 양식 이나 양계 사업에서 생산 균주의 파쇄 및 astaxanthin의 추출공정 없이 균체를 바로 섭취 시킬 수 있고, 조류나 곰팡이에 비해 배양 하기 용이하다는 등의 장점을 가지고 있다. 하지만, 아직 까지 Paracoocus를 이용한 astaxanthin의 생산성이 낮다는 단점이 있다. 따라서 본 논문에서는 astaxanthin의 생산성 향상을 위한 Paracoccus 배양의 최적화를 수행하였다. 반응표면분석은 전형적인 최적화 방법으로 일반적으로 여러 변수를 사용하여 최적 조건을 찾는 system(10)으로 하나의 변수와 다른 변수들과의 상호작용으로 인한 효과 를 측정하여 변수들의 최적값을 확인할 수 있는 분석법이 다. 따라서 본 연구는 Paracoccus를 이용한 astaxanthin 생산 의 산업적 이용 가능성을 알아보기 위해 반응표면분석을 사용하여 astaxanthin의 최대 생산성을 보여주는 배지의 조성을 조사하였다.

This study was to optimize the medium components for astaxanthin production in Paracoccus sp. through surface response methodology. A screening test was first conducted on 5 medium components using a Plackett-Burman design, from which MgSO4 and yeast extract were identified as the significant factors affecting astaxanthin production. These significant factors were optimized by central composite design of experiments and response surface methodology, as 2.83 g/L MgSO4 and 7.02 g/L yeast extract, respectively. The expected astaxanthin concentration with these optimized medium compositions were 0.925 mg/L. In flask culture, the experimentally obtained concentration of astaxantin was 1.021 mg/L, where it had been 0.4 mg/L before optimization.