Earticle

초록

영어

Rice cells were transformed to express human cytotoxic T-lymphocyte antigen 4-immunoglobulin (hCTLA4Ig) using RAmy3D promoter. hCTLA4Ig was produced and secreted into culture media inducibly when sugar was depleted. The obstacles of this system are the cell death and release of proteases by sugar starvation. These problems resulted in the losses of stability and productivity of hCTLA4Ig. Therefore, the effects of proline as an inhibitor of cell death were investigated. When 4 mM proline was added in sugar-free media, the cell death and release of proteases were reduced. As a consequence, the production of hCTLA4Ig was enhanced. In addition, the effects of protein stabilizers such as gelling agents were studied. It was found that the application of 0.01 g/L gelatin led to an increase in hCTLA4Ig production. This increase might be originated from the stabilization of hCTLA4Ig. In conclusion, the production of hCTLA4Ig could be enhanced by the additions of proline and gelatin in transgenic rice cell cultures.

한국어

Plant-made pharmaceuticals (PMPs)는 식물을 이용하여 생산되는 치료용 단백질을 일컬으며, human growth hormone fusion protein, interferon, monoclonal antibody, human serum albumin 등의 식물을 이용한 발현이 보고되었다. 식물세포 배양을 통한 치료용 단백질의 생산은 posttranslational modification (PTM)이 가능하고 분리 ·정제가 쉬우며 대규모 생산이 용이하다는 장점을 보유하고 있다(1). 이러한 형질전환된 식물세포를 이용한 치료용 단백질의 안정되고 정확한 발현을 위하여 promoter는 중요한 요소 이며, promoter에 의해 목적 단백질의 발현수준이 조절된 다. RAmy3D promoter는 벼의 종자 발아시 종자에 저장되어 있는 녹말을 분해하기 위하여 발현되는 α-amylase gene family 중 하나이며, Yu 등(2)과 Mitsunaga 등(3)은 α-amylase gene의 발현수준이 호르몬이나 당 고갈에 의해 조절되는 것을 확인하였다. 이렇듯 환경조건에 의해 조절 이 가능한 inducible promoter인 RAmy3D promoter는 총 11,519 bp로 이루어진 발현벡터 pMYN409에 hCTLA4Ig 유전자와 함께 삽입되어 재조합됨으로써 그 발현의 증가 가 보고되었다(4). 본 연구에서는 형질전환된 벼 현탁세포 를 이용한 hCTLA4Ig 생산시 당이 제거되었을 때 발현되 기 시작하는 RAmy3D promoter를 사용한 고발현 유전자 시스템을 선택하였다. Human cytotoxic T-lymphocyte antigen 4-immunoglobulin (hCTLA4Ig)은 T세포에 의한 면역반응에 관여하는 CTLA-4 (CD152)와 human IgG의 Fc 부분을 융합한 단백질이다. 그 결과, dimeric hCTLA4Ig를 형성하여 생체내에서의 반감기가 연장되었으며 또한 affinity chromatography에 의한 효과적인 정제가 가능하게 되었다(5). 면역반응 유발에 있어서 중요한 T세포의 co-stimulatory signal은 T세포 표면 의 CD28이나 CTLA-4와 antigen presenting cells (APCs) 표면의 B7 수용체 (CD80 및 CD86)간의 결합이다. 이 때, CTLA-4는 CD28과 반대로 T세포의 활성을 억제 하거나 감소시키는 신호를 전달하는 역할을 하며, B7 수용체와 약 20∼50배 높은 친화력을 보인다(Fig. 1). 따라 서 hCTLA4Ig는 T세포 특이적 면역억제 반응을 유도하여 면역억제제 역할을 한다(6). 2005년 12월 Bristol-Myers Squibb (BMS)사의 hCTLA4Ig는 자가면역질환의 일종인 류마티스 관절염 치료제로서 미국 FDA (USA Food and Drug Administration)에서 승인을 받아 Orencia® (abatacept) 라는 상품명으로 판매되고 있으며, 2008년 2분기에는 그 매출액이 1,500억 원에 이르렀다. 본 연구에서와 같이 식물세포 배양을 이용한 치료용 단백 질 생산의 경우, 세포 밖으로 분비된 목적 단백질은 여러 가지 기작에 의해 그 안정성이 낮아져 생산성에 커다란 영향을 미친다. 이런 단백질의 안정성에 영향을 미치는 요인 으로는 발현되어 배지로 분비된 단백질 자체의 구조적 특 징에 의한 불안정성이나 응집에 의한 불안정성이 있으며, 특히 배지내의 protease에 의한 목적 단백질의 분해는 생산 성에 가장 큰 영향을 미치게 된다(7). RAmy3D promoter 와 RAmy1A signal peptide를 이용한 형질전환된 벼 세포 의 경우, 당 고갈시에 목적 단백질의 발현이 강하게 이루어 지며 세포 밖의 배지로 분비된다. 하지만 이 시스템의 단점 은 당 고갈에 의해 생산이 유도되기 때문에 적절한 탄소 원이 없는 상태에서 목적 단백질을 합성하게 된다는 점이 다. 이러한 생산조건은 세포의 생존도 감소 및 사멸, 이로 인한 배지내로의 protease 분비 증가를 유발하여 목적 단백 질의 안정성 저해와 궁극적으로는 생산성 저해를 일으킨 다. 따라서 목적 단백질 안정성의 증진을 통하여 활성이 높은 완전한 생산을 유도하는 것이 필요하다. 이를 위하여, 배지의 환경조건을 조절하거나 안정제 역할을 하는 gelatin 과 같은 몇몇 gelling agent들을 첨가하여 목적 단백질의 생산성을 높이는 연구가 진행되고 있다(8). 또한 protease inhibitor를 이용하여 protease 활성을 낮춤으로써 목적 단 백질의 생산성을 높이는 연구도 보고되고 있다(9). 하지만 이러한 안정제와 protease inhibitor가 목적 단백질의 안정성 에 미치는 영향에 대한 정확한 기작을 알지 못하고, 항상 효과를 보이지는 못하고 있다. 따라서 목적 단백질 생산에 있어 보다 효과적인 첨가물질을 찾고 그 기작을 규명하기 위한 많은 연구들이 수행되어야 할 것이다. 본 연구에서는 형질전환 벼 세포배양을 이용한 hCTLA4Ig 생산에 있어서 세포의 생존도를 증진시켜 protease에 의한 단백질 분해를 낮춰줄 것으로 생각되는 첨가제인 proline 과 단백질 안정제로 알려져 있는 gelatin을 첨가함으로써 hCTLA4Ig의 생산을 증대시키고자 하였다.

목차

Abstract
 서론
 재료 및 방법
  세포배양
  세포량 측정
  Cell viability 측정
  Protease 활성 측정
  hCTLA4Ig 정량분석
  hCTLA4Ig 정성분석
 결과 및 고찰
  세포 사멸과 protease 분비
  Proline의 영향
  Protease 분비와 hCTLA4Ig 불안정성
  Gelatin의 영향
 요약
 감사
 REFERENCES

키워드

저자

• 송미나 [ Mi-Na Song | 인하대학교 공과대학 생물공학과 ]
• 전수환 [ Su-Hwan Cheon | 인하대학교 공과대학 생물공학과 ]
• 권준영 [ Jun-Young Kwon | 인하대학교 공과대학 생물공학과 ]
• 최성훈 [ Sung-Hun Choi | 인하대학교 공과대학 생물공학과 ]
• 김동일 [ Dong-Il Kim | 인하대학교 공과대학 생물공학과 ] Corresponding author

참고문헌

발행기관

간행물

표지보기 관심저널 등록

• 간행물명

  KSBB Journal

• 간기

  격월간

• pISSN

  1225-7117

• 수록기간

  2009~2013

• 십진분류

  KDC 476 DDC 576