Earticle

유전자 생물학 분야에서 적용가능 한 세포간 네트워크를 입증하는 고처리 정보공학에 응용하려는 수치학적인 표현 모델을 분석 연구한다. 확률적 그래프 모델을 사용하여 데이터 네트워크로부터 생물학적 통찰력을 확률적 함수적으로 응용해 복잡한 세포간 네트워크보다 단순한 하부모델로 구성하여 유전자 베이스네트워크 논리를 유전자 표현 레벨로 나타낸다. 유전자 데이터로부터 확률적 그래프 모델들을 분석하여 유전자 표현 데이터를 정보공학 네트워크 모델의 방법으로 확장 추론한다.

This study is a numerical representative modeling analysis for the application of the process that unravels networks between cells in genetics to web of informatics. Using the probabilistic graphical model, the insight from the data describing biological networks is used for making a probabilistic function. Rather than a complex network of cells, we reconstruct a simple lower-stage model and show a genetic representation level from the genetic based network logic. We made probabilistic graphical models from genetic data and extends them to genetic representation data in the method of network modeling in informatics

대장균을 회분배양하면서 알칼리소비속도를 온라인으로 모니터하고, 대수증식기에 IPTG로 재조합 단백질의 발현을 유도시키면 알칼리소비속도가 급격하게 감소하는 것을 확인 할 수 있다. 회분배양을 서로 다른 조건에서 7회 실시하고 β-galactosidase의 발현량과 발현유도 직후 알칼리 소비속도의 감소를 비교하여 알칼리소비의 감소가 클수록 발현량이 증가한다는 것을 알 수 있었다. 그러나 IPTG를 재투입하여도 발현량은 증가하지 않았고 배지를 추가로 공급하면 발현량이 증가한다는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터 외래단백질의 발현속도는 초기의 IPTG 투입시 결정되고 이후의 재조합단백질의 생산은 배지의 공급에 의하여 제한된다고 판단할 수 있다. 이와 같은 알칼리 소비속도는 Casamino acid를 질소원으로 사용할 경우 관찰 되었으나 Yeast extract를 유일한 탄소원으로 사용할 경우에는 관찰되지 않았다.

IPTG induction caused a sudden drop of alkali consumption rate during cultivation of a recombinant E. coli with β -galactosidase structural gene under T7 promoter on a plasmid. A series of batch cultivations showed the positive correlation of the decrease of alkali consumption and the level of expression. However, repeated IPTG induction did not cause any variation of alkali consumption rate. Supplementation of medium even at stationary phase enhanced the level of β -galactosidase expression. These results suggests that the drop of alkali consumption rate by IPTG induction represents the rate of expression.

용존산소 센서 및 시스템에서 손실되는 산소량을 보정하기 위해 멸균처리 기법을 도입하였다. 멸균처리 시료의 DO 거동과 비멸균처리 시료의 DO 거동차 (△DO)는 시스템의 영향과 무관하게 폐수 자체의 순수한 미생물만이 소모하는 산소변화량을 구하였다. 용존산소 센서로 축산폐수의 시간에 따른 DO거동 (-d△DO/dt)을 측정하여 구한 폐수자체의 미생물에 의한 산소소모속도는 0.00074mg O2/ℓ․ sec이었다. 축산폐수의 원액을 희석하여 다양한 BOD값을 갖도록 시료를 제조한 후 DO meter로 측정하여 구한 DO 변화량은 동일한 시료를 5일 BOD 측정방법인 Winkler Azide화 변법으로 구한 BOD값과 선형구간 (30〜60분)에서 97.72%의 높은 상관 선형성을 보였다. 따라서 본 연구의 multi-biosensor 시스템은 축산폐수의 BOD를 짧은 시간에 정확하게 측정할 수 있는 가능성을 제시하였다.

The present study was intended to examine a basic scheme to determine the biochemical oxygen demand (BOD) of livestock wastewater by means of six individual dissolved oxygen (DO) sensors and its multi-measurable meter. Maximal point of the first order time derivative of the DO difference between DO distribution of sterilized livestock wastewater and that of non-sterilized livestock wastewater, was considered as the oxygen uptake rate (OUR) of microorganisms in livestock wastewater, as determined to be 0.00074 mg O2/ℓ․sec. The present study showed that there was a fair linear relationship (97.72%) between maximal OUR and BOD values of livestock wastewater, the latter being determined by classical Winkler azide method. It was thus concluded that the present multi-biosensor system might be applicable to an on-line system for measurement of BOD of livestock wastewater.

본 연구에서는 CHO 세포를 이용해 세포를 별도의 적응기간 없이 무혈청 배지에서 배양했을 때 세포의 증식이 중단되는 원인을 찾고 배지 첨가 성분을 통해 이를 개선하고자 했다. 현재 개발된 무혈청 배지는 아직까지 혈청을 대체할 만한 성분을 포함하고 있지 않다. 때문에 무혈청 배지에 적응되지 않은 비적응 세포의 경우 계대 배양에 한계가 있다. 이런 한계가 나타나는 원인은 다양할 것으로 생각이 되지만 혈청의 부재로 인해 세포가 받게 되는 스트레스와 그로인한 세포주기의 정지가 가장 근본적인 원인으로 생각된다. 무혈청 배지에서 세포가 받는 스트레스의 정도를 알아보고 배양 환경과 첨가물에 따른 ROS 농도의 변화를 측정하기 위해 배지와 세포의 ROS 농도를 측정하였다. ROS 농도를 측정한 결과 무혈청 상태에서 세포내 ROS가 엄청난 양으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 이것은 혈청이 항산화능력을 갖고 있어서가 아니라 세포가 무혈청 환경에서 극심한 스트레스상태에 놓이기 때문인 것으로 생각된다. 이렇듯 증가한 ROS가 세포의 증식이 멈추게 되는 원인 중 하나로 생각되고, 항산화제를 첨가한 경우에도 증식력이나 ROS의 농도에 큰 차이가 없었던 것으로 미루어 보아 근본적으로 혈청과 같은 강력하게 증식을 촉진하는 성분을 배지에 첨가해야 할 것으로 여겨진다. ROS 이외에 세포의 증식이 멈추는 또 다른 원인으로 세포사멸의 여부를 확인했다. 무혈청 배지에서 배양한 적응세포와 비적응 세포 모두 특별한 세포사멸의 징후가 나타나지 않았다. 또한 무혈청 배지에서 증식이 멈춘 세포를 회수해 다시 혈청배지에서 배양한 경우 곧바로 증식력이 회복되기 때문에 대규모의 세포사멸은 발생하지 않는 것으로 생각된다. 위와 같은 현상들은 모두 혈청이 없기 때문에 발생하는 것으로 혈청을 대체할 수 있는 첨가물을 배지에 더해주면 세포의 증식이 개선될 것이다. 그래서 몇 가지 첨가물을 이용해 세포의 증식력에 변화가 나타나는지 알아보았다. 첨가물을 이용한 실험에서 IGF-I의 경우 장기간 배양에서 세포의 수를 안정적으로 유지하고 계대 횟수를 증가시키는 효과를 보였다. 이는 IGF-I이 어느정도 세포의 증식을 유지시켜주는 역할을 하기 때문인 것으로 생각된다. 무혈청 배지에서 비적응 CHO 세포의 계대 배양에 한계가 있는 것은 세포주기가 멈추기 때문인 것으로 생각된다. 세포주기가 멈추는 growth factor와 같이 세포의 증식을 지속적으로 유도할 수 있는 물질이 무혈청 배지에서는 부족하기 때문인 것으로 생각되고, IGF-I과 같은 첨가물을 통해 극복할 수 있는 문제라고 여겨진다.

Animal cell culture industry has a large market and an exponential growth rate among biological industry field. Chines hamster ovary (CHO) cells are the most widely used cell lines for recombinant protein production. They can avoid infection from polio, herpes, hepatitis B, HIV, measles, adenovirus and etc. Moreover it is easy to transfection recombinant genes and possible to suspension culture. Serum free media is one of the most important factor of protein production. Because serum has problems. Serum is not defined the contents until now, it has a number of proteins, lipids, carbohydrates and unknown molecules that cause of risk involve in infection and high cost of product purification. CHO cell line cultured using serum free media were the basis of a very successful method to produce (glyco-)protein in mammalian cells, which are then used as pharmaceutical products. Also, the low protein content of the developed medium facilitates downstream processing and product purification. But non-adapted CHO cells have a limit of proliferation cultured using serum free media and it takes very long time to adapt non-adapted cells to serum free media. There are a number of causes of a limit of proliferation using serum free media. Absence of growth factors and growth stimulating molecules is a major factor of the reasons. It makes growth signals and moves cell cycle. And increase of cellular stress is another reason. It induces increase of intraceullar ROS concentration. The purpose of this study is about improvement of proliferation capacity of non-adapted CHO cells cultured using serum free media without adaptation process.

생체 적합성이 우수한 히아루론산과 생분해성이 우수한 폴리락타이드의 이량체인 락타이드의 혼합 몰비, 가교제 EDC 농도, 가교 온도 등의 반응 조건을 변화시켜 생체적 합성 고분자막을 제조하였다. 히아루론산에 대한 락타이드의 혼합 몰비가 증가할수록 수용액상에서의 분해속도는 감소하였다. 합성된 고분자막을 ethylene oxide gas로 멸균한 후 세포배양배지를 첨가하여 37℃에서 200 rpm으로 24시간동안 교반하면서 침출물을 추출한 다음 NIH/3T3 섬유아세포에 대한 세포독성을 측정하였다. EDC 농도 10% 조건에서 히아루론산에 대한 락타이드의 혼합 몰비가 5 또는 10에서는 세포독성을 나타내지 않았지만 몰비 13에서는 11% 정도의 성장저해를 나타내었다. 혼합 몰비를 10으로 고정하고 가교 온도 15℃에서 EDC의 농도를 5%, 10%, 20%로 변화시켜을 때, EDC 농도가 20%인 경우에서만 12% 정도의 성장저해를 나타내었다. 혼합 몰비 10, EDC 농도 10% 조건에서 가교 온도를 15℃, 25℃, 28℃로 변화시켰을 때, 가교 온도에 따른 세포독성은 나타나지 않았다. 따라서 락타이드와 히아루론산의 몰비와 EDC의 농도를 조절함으로써 인체 내에서 분해 속도를 조절할 수 있는 새로운 생체적합성 고분자막을 제조할 수 있을 것으로 사료된다.

The biodegradable hyaluronic acid (HA) membranes cross-linked with lactide using the crosslinking agent, 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC) were prepared as a potential biocompatible material for tissue engineering. HA membranes having different mechanical properties were synthesised by varying degree of the mole ratio of lactide to HA, EDC concentration, and crosslinking temperature. HA membranes were degradable in water solution and the degradation became slower with the increasing mole ratio of lactide to HA. HA membranes were sterilized using ethylene oxide gas and extracted with cell culture medium for 24 h at 37℃ and 200 rpm. Cytotoxicity of the extract was tested using NIH/3T3 mouse embryo fibroblast as a model cell. Growth inhibition was not observed in the extracts of HA membranes with the mole ratios of lactide to HA, 5 or 10, and 10% EDC concentration, however 11% of growth inhibition was observed in the extract with the mole ratio of 13. Growth inhibition was not observed in the extracts of HA membranes prepared with 5% EDC or 10% EDC and the mole ratio of lactide to HA, 10, however 12% of growth inhibition was observed in the extract with 20% EDC. Cytotoxicity was not observed in the extracts of HA membranes prepared at varying crosslinking temperatures, 15℃, 25℃, and 28℃ with the mole ratio of lactide to HA, 10 and 10% EDC.

본 연구에서는 P. pastoris를 이용한 유전자 재조합 HBsAg 생산에서 메탄올 유도시 여러 가지 첨가물들의 영향에 대해서 알아보았다. 회분식 배양에서 탄소원으로 글리세롤을 사용하다가 유가식 배양의 공급 탄소원으로 글리세롤이 아닌 당알콜인 sorbitol로 대체하였을 때 단백질 발현이 향상된 결과를 보였다. 또한 메탄올 유도시에 적당량의 아미노산 혼합물 첨가는 세포증식에는 영향이 없었지만 단백질 발현율은 크게 증가시켰다. 계면활성제인 Trition X-100의 첨가는 세포증식과 단백질 발현을 현저히 감소시켰지만, Pluronic F-68를 첨가했을 경우 세포증식의 저해영향 없이 단백질 발현율을 향상시켰다. 배지 부피의 0.01% (v/v)으로 oleic acid를 첨가하면 플라스크 배양에서는 단백질 발현에 긍정적인 효과를 보였으나, 5 L 발효조 배양에서는 메탄올 유도 시간이 지속되면서 첨가하지 않은 경우에 비해 발현율이 낮아지는 결과를 보였다. 마지막으로 trace salts는 첨가량에 따라 세포증식에는 영향이 없으며 단백질 발현에는 소량 trace salts 첨가로 단백질 발현에 긍정적인 효과를 보였다. 하지만 첨가량이 많아질수록 단백질 발현에는 부정적인 영향을 보임을 확인할 수 있었다.

Methanol induction conditions with various additives for the enhanced production of recombinant hepatitis B surface antigen (HBsAg) were investigated in Pichia pastoris, which can utilize methanol as a carbon source and produce recombinant proteins under the control of strong, tightly-regulated alcohol oxidase (AOX) promoter. The presence of non-methanol carbon sources such as glycerol and glucose fully repressed the expression of AOX promoter. Various additives were tested to improve the production of recombinant protein and it was found that sorbitol could be a good carbon source during methanol induction period. An optimized concentration of amino acid mixture enhanced the production of HBsAg significantly. Pluronic F-68, a non-ionic surfactant, also improved the production of HBsAg without inhibiting cell growth. Addition of oleic acid at 0.01% (v/v) during the induction period showed positive effect on the production of HBsAg. Finally, 1.2% (v/v) of trace salts enhanced the production of HBsAg 1.9 times compared to that of control culture.

주정공장 근처 토양에서 분리한 에탄올 발효균주 KJ는 Saccharomyces italicus로 판명되었으며, glucose가 최적의 탄소원으로 확인되었다. 균주 KJ의 최적배양조건은 온도 30℃, 초기 당 농도 10%, 초기 pH 5 근방, 혐기조건으로 판명되었다. 초기 탄소원이 동일한 조건에서 YM배지 (glucose 10g/L)와 SFW배지 (RS 10 g/L)에서 에탄올 생산은 각각 5.34, 5.68 g/L로 나타나, KJ균주는 음식물쓰레기 당화액을 에탄올 발효배지로 적절하게 사용될 수 있음이 확인되었다. 에탄올 생산배양에 SFW의 이용은 에탄올생산단가를 대폭 낮추게 하여 대체에너지인 에탄올의 대량생산기술의 경제성을 확보하는데 크게 기여할 것이다.

Five strains producing ethanol were isolated from soil near traditional alcohol production factory in Gwangju, Korea. One of the isolated strains maintained relatively stable ethanol production in shaking culture. The isolated strain KJ was proved to be Saccharomyces italicus, based on several biochemical and morphological tests containing assimilation of carbon compounds. In investment of the most suitable carbon for ethanol production, ethanol concentration of 5.46 g/L and yield of 0.53 g-ethanol/g-glucose were obtained in condition of glucose 10 g/L in YM medium. Experimental optimal conditions for ethanol fermentation by S. italicus KJ were as follows; temperature 30℃, initial pH 5.0, initial concentration 10% of glucose, anaerobic condition in the liquid cultivation. When enzymatically saccharified food wastes (SFW) were used as the production medium, ethanol production yield was 0.57 g-ethanol/g-reducing sugar. Therefore, SFW will contribute to lower the production cost of ethanol for industrial application.

박테리아 패터닝을 위한 혼성 아가로즈젤 마이크로 스탬프는 PDMS 몰드를 이용한 replica moding 공정을 이용하여 제작하였다. 완성된 스탬프를 박테리아를 잉크로 사용한 후, 50 μm 원 모양을 가지는 2차원 박테리아 어레이를 구현할 수 있었다. 또한, 상기 방법을 통하여 실험 목적에 적합한 다양한 모양을 가지는 패턴을 쉽게 만들 수 있다. 패터닝된 박테리아의 형광 세기는 스팟과 주변간에 매우 높은 대조비를 이루며, 각각의 스팟 및 스팟간의 형광 세기가 매우 균일함을 보여 프린팅 시 매우 균일한 패 턴을 얻을 수 있었다. 박테리아 패터닝을 할 경우 큰 문제점인 낮은 젖음성과 미끄럽고 작은 아가로즈젤 마이크로 스탬프를 취급의 어려움을 본 연구에서 제안한 혼성 아가로즈젤 마이크로 스탬프를 이용하여 해결할 수 있었다. 상기 방법의 가장 큰 장점은 세포를 이용한 패터닝의 경우 세포의 활성을 유지시키는것인데 다량의 수분을 포함하는 아가로즈젤을 사용할 경우 세포의 활성을 유지시키면서 패턴을 구현할 수 있으므로 매우 중요한 기술로 생각된다.

The noble method of hybrid agarose gel microstamp fabricated by replica molding against PDMS master to make bacteria patterns on agar surface was presented. After the fabricated hybrid agarose gel microstamp was inked with E. coli, we could obtain 2 dimensional bacterial arrays with 50 μm circular spots. And the various shaped patterns based on experimental design were easily generated. The analysis of mean fluorescent signal was showed that bacterial pattern have high contrast between spots and background and homogeneity of pattern. Our proposed method solved the problem of wetting and handling with small soft agarose gel microstamp when bacteria were used for ink. The agarose gel stamp provides appropriate environment to inked bacteria, which is essential technology for cell patterning with high retaining viability during the patterning process. This method is reproducible, convenient, rapid, and could be applied to screening system, study of cell-surface interaction, and microbial ecology.

본 연구에서는 trypsin을 모델 단백질로 하여 단백질 본연의 활성을 유지할 수 있는 고정화 방법을 찾기 위하여 공유결합방법과 친화력 결합방법을 이용하여 trypsin을 고정화하였다. Streptavidin-biotin system을 이용한 고정화 방법은 bioactivity 유지측면에서 공유결합 방법보다 우수함을 확인하였다. 하지만 streptavidin-biotin system을 이용하였을 때 고정화 수율이 낮은 것은 해결해야 할 과제이다. 분자량이 다른 기질들 (BAPNA, insulin, BSA)을 대상으로 고정화 trypsin의 부위 특이적 절단 특성을 분석한 결과 streptavidin-biotin에 의해 고정화된 trypsin이 절단효율도 높고 sequence coverage도 높은 것으로 확인되었다. 또한 공유결합된 trypsin은 견고한 분자구조를 나타낸 반면 streptavidin-biotin system으로 고정화된 trypsin은 유연성이 높은 것을 QCM-D를 이용하여 관찰할 수 있었다. 따라서 streptavidin-biotin system에 의한 고정화 방법에서 streptavidin- biotin 결합이 일종의 spacer arm 역할을 하면서 고정화된 trypsin의 분자유연성을 향상시켜 절단반응의 부위특이성과 절단수율을 향상시키는 것으로 판단되었다.

We investigated the effects of immobilization chemistry on the yield of immobilization and the bioactivity of the immobilized enzymes. Trypsin as a model protein and macroporous polymer beads (Toyopearl AF 650M, Tosho Co., Japan) was used as a model matrix. Four methods were used to immobilize trypsin; covalent conjugation by reductive amination (at pH 10.0 and pH 4.0) and affinity interaction via streptavidin-biotin, and double-affinity interaction via biotin-streptavidin-biotin system. The covalent conjugation immobilized 3~4 mg/ml-gel, ca. 3-fold higher than the affinity method. However, the specific activity of the covalently (pH 10.0) and affinity-immobilized trypsin (via streptavidin-biotin) are ca. 37% and 50%, respectively, of that of the soluble enzyme (on the low-molecular-weight BAPNA substrate). When the molecular size of a substrate increased, the affinity-immobilized trypsin showed higher clavage activity on insulin and BSA. This result seemed to indicate the streptavidin-biotin system allowed more steric flexibility of the immobilized trypsin in its interaction with a substrate molecule. To confirm this, we studied the molecular flexibility of immobilized trypsin using quartz crystal microbalance-dissipation. Self-assembled monolayers were formed on the Q-sensor surface by aminoalkanethiols, and gultaraldehyde was attached to the SAMs. Trypsin was immobilized in two ways: reductive amination (at pH 10.0) and the streptavidin-biotin system. The dissipation shift of the affinity-immobilized trypsin was 0.8 × 10-6, whereas that of the covalently attached enzyme was almost zero. This result confirmed that the streptavidin-biotin system allowed higher molecular flexibility. These results suggested that the bioactivity of the immobilized enzyme be strongly dependent on its molecular flexibility.

본 연구에서는 적효모 X. dendrorhous KCTC 7704로부터 여러 β-ionone 내성 변이균주를 선별하였다. 야생균 KCTC 7704는 β-ionone 0.025 mM 농도에서 생육이 현저히 저하되었지만, NTG처리 후 β-ionone 0.1 mM 농도에서 선별된 변이균주는 β-ionone 0.15 mM에서도 70% 이상의 상대 생육율을 나타내는 매우 강한 β-ionone 내성을 갖고 있었다. 여러 β-ionone 농도에서 선별한 변이균주들을 20°C에서 4일간 회분식 발효로 배양하여 그 특성을 조사하였다. 선별된 가장 우수한 변이균주는 야생균주보다 카로티노이드 생성능이 2.3배 향상 (즉 1.2 μg of total carotenoids per mg of dry cells)되었으며 유기산과 같은 대사산물은 거의 생성하지 않았다. 여러 탄소원 들에 대한 비교 발효특성 연구 결과 과당이나 자당을 사용했을 때와 비교하여 포도당 배지에서 최종 균체농도 및 총 카로티노이드 생성량이 많았다. 포도당이 제한되는 연속발효 (dilution rate 0.04 h-1) 실험을 통하여 pH의 영향을 조사한 결과 균체농도 및 총 카로티 노이드 생성은 pH 4.0 조건하에서 최적인 것을 알 수 있었다.

Various β-ionone resistant mutants were isolated from the wild-type red yeast Xanthophyllomyces dendrorhous KCTC 7704. Although the growth of X. dendrorhous KCTC 7704 was strongly inhibited at 0.025 mM β-ionone, one of the β-ionone resistant mutants isolated at 0.1 mM β-ionone by NTG mutagenesis showed rather 70% of relative survival at 0.15 mM β -ionone. Fermentation kinetics study with the mutant was carried out at 20℃ for 4 days in 300-mL baffled flasks. The mutant yielded up to 2.3-fold higher carotenoids content (viz. 1.2 μg of total carotenoids per mg of dry cells) compared with the wild-type strain. The production of metabolites such as organic acids could be neglected. Studies on the kinetics with various carbon substrates revealed both an increase in final dry cell mass and a higher total carotenoids content in cell mass with glucose when compared to fructose or sucrose. As a further part of study, the effect of pH on the fermentation kinetics was investigated in glucose-limited chemostat at a dilution rate of 0.04 h-1. When compared to steady-state kinetic parameters obtained at pH 4.0, a significant reduction in cell concentration at pH 3.0 and a lower carotenoids content at pH 5.2 were evident.

본 연구에서는 상황버섯의 수용성 추출물을 이용하여 PPAECs 세포의 발아에 미치는 효과 및 그 작용기작을 알아보고자 하였다. 상황버섯 추출물을 10~50 μg/mL 농도로 처리하면 PPAECs 세포의 발아가 약 38~58% 억제되었으나, 200~400 μg/mL 처리군에서는 약 1.42~1.47배의 발아 증가를 유도하였다. PPAECs 세포에 상황버섯 추출물을 처리한 결과, MMP-2는 상황버섯 추출물 농도 50 μg/mL까지는 약 30% 정도 분비가 억제되다가 100 μg/mL에서부터 증가하기 시작하여 400 μg/mL에서는 약 1.7배의 MMP-2 분비증가 효과를 나타냈다. 이에 비해 MMP-9의 분비는 농도-의존적으로 감소되었으며, MMP-3는 50~400 μg/mL에서 약 1.5~1.7배의 분비 증가 효과를 보였다. 또한 100~200 μg/mL 농도의 상황버섯 추출물에서 피브린 젤의 용해 및 MMP-2의 활성화에 관여하는 플라스민의 분비증가가 약 2.4배 유도되었다. 한편 상황버섯 추출물 처리시 고농도 (100~400μg/mL)에서 PPAECs 세포의 발아가 촉진되었으며, 이러한 효과는 MMPs 및 플라스민 억제제에 의해 약 40~44% 억제되어 피브린 젤에서 확인된 상황버섯 추출물에 의한 발아 증가는 MMPs 및 플라스민의 분비증가에 의한 것이라 사료된다.

One of the steps in angiogenesis is the degradation of the underlying basement membrane via proteases. Endothelial cells release proteinases to degrade the extracellular matrix for their sprouting in vivo. In this study, we examined the effect of water extracts of Phellinus linteusis (Phellinus extracts) and combination of Phellinus extracts and fibroblast growth factor(FGF-2) on cultured porcine pulmonary artery endothelial cells (PPAECs). Phellinus extracts induced sprouting of PPAECs, which was inhibited by MMPs and plasmin inhibitors, and induced the secretion of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) and plasmin. At high concentration of Phellinus extracts (200~400 μg/mL), the active MMP-2 secretion was induced. It is therefore, suggested that Phellinus extracts induces the sprouting of cultured endothelial cells by means of increased active MMP-2 and plasmin secretion. Also, combination with Phellinus extracts and FGF-2 produced an enhanced effect on sprouting and secretion of active MMP-2, and MMP-3 and plasmin from PPAECs.

트레할로스 합성효소 (trehalose synthase)의 효율적인 생산을 위하여, 5 종류의 plasmid를 형질전환 시킨 재조합 E. coli를 이용하여 균체생산량과 효소발현량을 비교하였다. Trehalose synthase의 활성은 fusion partner를 이용한 system에서는 활성이 나타나지 않았으며, IPTG 유도 발현 시스템보다 항시적 발현 시스템을 사용하는 E. coli K12/pHCETS에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 선별된 재조합 E. coli K12/pHCETS를 사용하여 회분식 및 유가배양을 수행하였으며, 유가식 배양의 경우 균체논도는 20 g/l, 최종 trehalose synthase 활성은 13.7 U/ml을 나타내었다. 이러한 결과는 트레할로스 생산을 위한 trehalose synthase가 재조합 E. coli의 발효에 의해 경제적으로 생산되어질 수 있다는 가능성을 보여 주었다.

A gene (GeneBank AF 135796) coding for a trehalose synthase from Thermus caldophilus GK24 was cloned into Escherichia coli K12 using five vector systems. The constitutive expression system (pHCETS) which shows the highest trehalose synthase activity from flask culture of recombinant E. coli was selected for the production of trehalose from maltose. For the shake flask culture, the final dry cell weight was 0.9 g/L and the trehalose synthase activity was 25 U/mL. Fed-batch culture of recombinant E. coli harboring plasmid pHCETS which uses the glycerolas a carbon source was performed in jar fermentor: the dry cell weight of 20 g/L and the trehalose synthase activity of 13.7 U/mL were attained in 48 h.

PCR증폭기술 및 무세포 단백질 발현 기술의 융합을 통하여, 여러 형태로 서열의 일부가 결손된 단백질들을 고속으로 발현할 수 있는 시스템을 구축하였다. Exonuclease 및 endonuclease에 대한 mRNA의 안정성 향상을 통하여, PCR 증폭을 통해 획득한 선형 DNA로부터의 안정적인 단백질 발현이 가능하였다. 동일한 플라스미드로부터 출발하여 수 시간 이내에 C-말단의 아미노산서열이 순차적으로 제거된 다양한 형태의 트랜스아미나제 Vf의 활성변화를 확인할 수 있었으며 이같은 기술은 각종 효소 단백질의 서열-활성 상호관계의 연구를 위한 유용한 기반을 제공할 것으로 기대된다.

In this work, we attempted the application of cell-free protein synthesis technology for the rapid generation of truncated enzymes. Truncated DNAs of a transaminase were PCR-amplified and directly expressed in cell-free protein synthesis reactions. Variants of the transaminase were rapidly prepared and analyzed for their enzymatic activity. Described method that combines the PCR and cell-free protein synthesis technologies will offer a versatile platform for the rapid generation of optimally modified protein species.

세포의 보존은 세포의 배양에 있어서 필수 불가결한 요건으로서 세포주의 다양한 특성에 따라 적합한 방법이 확립되어야 한다. 본 연구에서는 산업용 세포주인 CHO 세포의 단기간 저온보존 기술의 확립을 목표로 진행되었으며 다양한 조건을 통해 가장 안정적인 저온보존 방법을 수립하였다. 저온보존 방법에 있어서 가장 중요한 요인은 온도로서 4℃ 저온보존이 세포 보존에 필수적인 조건으로 나타났으며 20℃ 실온보존에서는 세포의 급격한 사멸이 관찰되었다. 보존형태는 용기를 눕힌 상태로 서서히 회전시 켜 현탁 보존하는 방법이 용기를 세우거나 눕혀 보관하는 방법에 비해 높은 생존율을 나타내었다. 또한 저온보존 시새로운 배지로 교환한 후 보존하는 방법이 배양에 사용된 배지를 그대로 사용한 보존 방법보다 세포의 성장 회복율에서 우수한 것으로 나타났다. 하지만 4℃에서 rolling을 통한 현탁 보존을 할 경우에는 배지의 교환 없이도 안정적으로 세포보존이 가능한 것으로 나타났다. 저온보존에 가장 적합한 세포의 농도는 실험결과 1.0 × 106 ~ 5.0 × 106 cells/mℓ 범위로 나타났으며 혐기적인 상태로 보존하는 것 이 공기가 존재하는 보존방법 보다 비교적 우수한 보존결과를 나타내었다. 이상의 결과를 바탕으로 무혈청 배지의 저온보존액으로서의 안정성과 첨가물에 의한 보존효율의 향상을 평가하였다. 실험결과 저온보존 후 10일간은 높은 세포 생존율과 함께 정상적인 세포 성장 회복을 보이는 것으로 나타났으며 α-tocopherol과 retinoic acid를 첨가한 저온보존액의 경우에는 더욱 우수한 세포 생존율을 보임을 확인하였다. 마지막으로 이렇게 확립된 방법을 이용하여 1 L 용량의 저온보존 실험을 수행한 결과, 앞선 실험에서와 유사한 경향의 세포 보존 능력을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 산업용 세포주로 널리 사용되는 CHO 세포의 저온보존은 본 연구에서 확립된 방법을 통해 단기간 동안 안정적으로 수행될 수 있을 것으로 사료되며 대용량 저온보존의 적용 가능성도 확인하였다. 대용량 배양에서의 단기간 보존기술에 대한 연구가 앞으로 더 많이 수행된다면 실제 배양 공정에서도 저온보존 기술의 적용이 가능할 것으로 판단된다.

Cell preservation is indispensable in animal cell culture process and should be established according to the cell characteristics. In this study, we experimented hypothermic preservation of CHO cells that is widely used in pharmaceutical industry to produce therapeutic proteins and established a stable method of preservation. The highest viability of CHO cells was obtained when the cells were preserved using rolling tube, which means the cells should be suspended to avoid the cell lumping during the preservation. Also, we obtained superior preservation result under the anaerobic condition. To evaluate the serum-free media as a preservation solution, we investigated cell growth after hypothermic preservation using serum-free media. High cell viability and normal cell growth was observed during 10 days using serum-free media. Moreover, we found that more effective preservation when α-tocopherol and retinoic acid is added to media as an additive. In the case of 1 liter large scale hypothermic preservation using established protocol, cell viability and growth rate was obtained as good as small scale one. This study is considered to be helpful for hypothermic preservation of CHO cells and large scale hypothermic preservation may be available through the further studies.

본 연구에서는 은행잎 추출물의 staphylococcus aureus에 대한 항균효과를 검증하기 위해 먼저 에탄올 농도별로 bilobalide와 ginkgolide A, B의 성분을 분석한 결과 40% 에탄올 용매를 최적 활성농도로 결정하였다. Disc diffusion test, Optical density test을 통한 S. aureus 항균실험 결과 에탄올 추출농도가 증가할수록 항균효과가 증가하나 40% 에탄올 이상에서는 항균활성에 큰 차이가 없었다. 주사전자현미경을 통하여 은행잎 에탄올 40% 추출물 16배 농축액을 처리한 균의 세포표면을 확인한 결과 심하게 손상되었음을 확인할 수 있었다. 투과전자현미경을 이용하여 관찰한 결과 은행잎 추출물로 처리한 균주에서는 세포벽이 관찰되지 않았으며, 이는 은행잎 추출물의 주성분인 bilobalide와 ginkgolide A, B가 세포벽 합성을 저해하는 것으로 보여진다.

A optimal condition for the Ginkgo biloba extraction in ethanol and water binary solvent system has been proposed based on concentration of bilobalide and ginkgolide known as having a antimicrobial components in the range 5% to 70% ethanol in water at 80℃. Concentration of bilobalide as a single component of Ginkgo biloba leaves extract is the highest at the 60% ethanol and ginkgolide A and B is highest at 50% ethanol. Antimicrobial effect of Ginkgo biloba leaves extracts on the S. aureus was also examined by disc diffusion test and optical density test. In case of the disc diffusion test, the clean zone diameter was increased from 0.95 cm to 1.70 cm as ethanol concentration increased from 5 to 70%. However, over the 40% of ethanol concentration the antimicrobial effect was almost flat. Based on these results, we propose that the 40% of ethanol and 60% water solvent is most desirable for Ginkgo biloba extract considering vapor pressure problem in concentrating process after extraction. We introduced SEM and TEM to figure out the morphological change on the surface and inside body of S. aureus when Ginkgo biloba leaves extract was treated. After mixed with Ginkgo biloba leaves extract blast like blebs appeared on the surface of S. aureus cells and cell wall was not observed. From the these results, it seems that the Ginkgo biloba leaves extract including bilobalide and ginkgolide A, B prevent cell wall synthesis.

본 연구는 다가올 물 부족에 따른 하나의 대안으로서 중수도 시스템에 초점을 맞추어, 생활오수를 이용하여 혐기/무산소/호기조의 A2O 생물막 공법으로 구성된 상향류식 고정상 담체 반응기로 처리한 오수를 하향류식 은나노 모래여과 반응기에 다시 연속 통과시켜 이중 처리하여 얻은 처리수를 중수도에 활용이 가능하지에 대하여 연구하였다. 이중 공정 후 배출수의 pH는 7.39～8.06 (평균 7.84) 범위이었고, CODMn은 8～18 mg/L (평균 12.1 mg/L), BOD5는 2.1～10 mg/L (평균 4.9 mg/L)로 중수도 수질 기준에 적합하였다. SS는 3～9 mg/L의 범위로 평균 농도가 4.95 mg/L를 나타내면서 SS 제거율이 94.8%로 대부분 법적 기준치 5 mg/L 이하로 처리되어 가능성을 보여 주었다. 대장균군수의 평균 제거율이 99.1%이었으며, 배출수의 평균 대장균군수는 65 MPN/100mL이 검출되었으나 중수도 수질 기준에는 불검출로 되어 있으므로 완벽한 제거를 위해서는 0.2mg/L 이상의 결합잔류염소의 양을 고려한 염소 처리를 하여야 한다. SEM 사진으로부터 은모래 표면에서는 박테리아가 존재하지 않음을 알 수 있었다. 이 외에 중수도 수질기준에 포함될 가능성이 있는 총질소 및 총인의 제거율은 각각 50.3%와 27.2%이었다.

This study focused on the availability of wastewater reclamation and reusing system as one of the alternatives against the global water shortage in near future, which system is composed of two treatment steps; first, wastewater is injected into upflow A2O biofilm process (anaerobic/anoxic/oxic) reactor filled with polyethylene fixed-media , and the effluent of 1st steps continuously passed through downflow nano silver sand filter. The pH of the effluent ranged from 7.39 to 8.06 (average 7.84), the CODMn was 8～18 mg/L (average 12.1 mg/L), and BOD5 was 2.1～10.0 mg/L (average 4.9 mg/L), that met all the wastewater reclamation and reusing system criteria. Besides, the SS concentrations of the effluent which was 3～9 mg/L (average 4.95 mg/L) met the criteria (5 mg/L), showing 94.8% of average removal efficiency. The 99.1% of the average removal efficiency of the E-coliform did not met the criteria(Not detected), which indicates the needs for the following chlorine disinfection treatment with the residual chlorine concentration of above 0.2 mg/L. There are no bacteria on the sand surface coated by nano silver. The removal efficiency of T-N and T-P that could be included into the criteria in the future was 50.3% and 27.2% respectively.