Earticle

Sepharose CL-6B의 기능기를 aldehyde기로 활성화시킨 후 urokinase와 공유결합 시켜 고정화하는 방법을 6 mL 규모에서 250 mL 규모로 스케일업한 결과 고정화 수율 및 고정화된 UK에 의한 절단반응 수율 등에서 스케일업 전후의 결과에 차이가 없었다. 따라서 위의 고정화 방법의 scale-up 효능은 매우 우수한 것으로 나타났다. hGH와 GST 절편으로 구성된 융합 단백질의 고정화 UK 칼럼에 의한 절단 반응 후 용출액의 pH를 3.5로 낮춤으로써 이물질들을 침전시키고 이를 expanded bed chromatography 칼럼에 통과시킨 결과, 이물질들의 제거와 hGH 단량체의 흡착분리가 동시에 이루어졌다. 흡착된 단량체는 NaCl에 의해 용출되었으며 이 단계의 수율은 거의 100%이었다. 따라서 칼럼에 의한 절단 반응과 산 침전에 의한 이물질 침전 반응, EBA에 의한 이물질 제거 및 단량체 회수 반응을 연속적으로 진행할 수 있는 기초를 제시하였다. 또한 고정화된 UK는 guanidine HCl(6 M)을 이용하여 unfolding시키고 이를 세척하여 refolding 시킨 결과 20회의 반복적인 처리 후에도 초기 활성의 약 80% 수준을 유지하였다. 이는 UK가 공유결합된 상태에서 solid-phase refolding이 가능하다는 증거이며, 고정화 효소 칼럼의 수명을 크게 향상시켜 경제성을 확보하는 방안으로 이용될 것으로 기대된다.

We scaled up a covalent immobilization system of urokinase to the activated Sepharose and used it repeatedly to cleave a fusion protein consisting of human growth hormone and GST fragment. After scale up from 6 ml to 250 mL, the column system still demonstrated basically the same performance in terms of urokinase immobilization and fusion protein cleavage. When the column was washed with 6 M guanidine HCl after the cleavage reaction, the immobilized urokinase showed no activity probably because it was fully unfolded. However, as the denaturant was gradually removed from the column the immobilized urokinase fully regained its bioactivity, which indicated it was properly refolded into its native conformation as covalently attached to the solid matrix. After 20 cycles of this 'solid-phase unfolding/refolding', the immobilized urokinase maintained approx. 80% of the initial bioactivity. This method provides an efficient protocol to apply the solid-phase refolding technique to improve the longevity of immobilized enzyme columns.

재조합 대장균에서 내포체 형태로 발현시킨 LK68을 생물학적 활성을 가진 native한 단백질로 재생시키기 위해서 PBA 크로마토그래피와 EBA 크로마토그래피를 이용한 고체상 재접힘을 수행하였다. 내포체와 세포파쇄액을 시작물질로 하여 재접힘 공정을 수행하였으며 총 단백질 회수율과 재접힘 수율을 비교한 결과, EBA 공정이 기존의 액상 재접힘이나 PBA를 이용한 재접힘 공정에 비하여 우수함을 확인하였다. 또한 Iysine binding, RP-HPLC, SEC-HPLC, Ellman method 등을 사용하여 분석한 결과 재접힘된 LK68이 native LK68와 동등함을 확인하였다. 본 연구를 통해 EBA 크로마토그래피를 이용한 재접힘 방법은 재접힘 단계의 수율을 향상시킬 뿐 아니라 공정 단계, 시간 등을 감소시켜 공정 성능을 전체적으로 향상시킬 수 있음을 제시하였다

LK (lipoprotein kringle) 68’is a polypeptide of a modified ansiostatin consisting of three kringle structures that might be clinically useful as a potential cancer therapeutics. It can be produced by overexpressing it as inclusion body in recombinant E. coli. In this study, solid-phase refolding processes using packed bed adsorption (PBA) and expanded bed adsorption (EBA) column were carried out to compare their refolding yields with that of the conventional, solution-phase refolding process, For the solution-phase and the PBA-mediated processes employing Q-Sepharose, washed inclusion body was used as the starting material, whereas both washed inclusion body and E. coli homogenate were used for the EBA-mediated process employing streamline DEAE. On the final recovery LK68 per unit mass of wet cell basis, the EBA- and PBA-mediated processes showed about 2.7- and 1.5-fold higher yields, respectively, than the solution-phase refolding method. The solid-phase refolded LK68 demonstrated the same Iysine binding bioactivity and the retention time in the RP-and SEC-HPLC as those of the native protein

융합단백질의 절단을 위해 EK를 고정화하여 액상 절단반응과 같은 80%의 절단수율을 얻을 수 있었다. 그리고 니켈친화칼럼을 이용하여 간단한 정제공정을 구축하였다. 공유결합한 EK의 경우 니켈친화 결합한 EK보다 높은 재접힘 수율을 나타내었고 풀림과 재접힘을 이용하여 효소의 초기 활성을 회복함에 따라서 반복사용을 통한 경제적인 절단공정을 구축할 수 있게 되었다. 그러나 고정화 과정에서 효소의 활 성이 감소하는 문제점과 고정화 수율을 높이기 위한 연구가 필요하다.

Solid-phase refolding of immobilized proteins can be an effective way to reuse an immobilized enzyme column. Oriented immobilization methods are known to provide higher activity of the immobilized enzymes. In this study, using recombinant EK (enterokinase) as a model enzyme and a fusion protein, that consisted of recombinant human growth hormone and six His tag that was linked by the peptide of EK-specific recognition sequence, as a model substrate, we evaluated two oriented immobilization methods, i. e., reductive alkylation of N-terminus α-amine and affinity interaction between poly-histidine tag and Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid). The immobilization yield, activity and cleavage of the immobilized enzymes, and the yield of solid-phase refolding were compared. The Ni affinity immobilization and the covalent immobilization yields were about 100% and 65%, respectively. But the specific activities were the same, about 50% of that of the soluble enzyme. The cleavage rate by the covalently immobilized EK was higher than the soluble enzyme and the side reaction of cryptic cleavage was significantly decreased. Covalently immobilized EK showed almost 100% refolding yield but the affinity immobilized EK showed only 70% yield, which suggested the covalent conjugation provided more rigid ‘reference structure' for the solid-phase refolding. The monomeric hGH could be easily obtained by capturing the cleaved poly Histidine tag by the Ni affinity column.

Poly-lysine이 tagging된 hEGF와 angiogenin(6L10E5A)의 융합단백질의 고체상 재접힘이 heparin-Sepharose column에서 수행되었을 때, untagging 단백질(E5A)의 기존의 액상 재접힘방법과 비교하여 재접힘 수율은 약 13배 정도 증가하였다. 게다가 poly-lysine tagging된angiogenin은 heparin에 친화도를 높여주므로 2.5배에서 3배 정도의 흡착 수율이 증가한다. 재접힘 수율은 고체상 반응으로 인해 높은 재현성을 보였다. 재접힘 공정시간은 대략 8배 단축되었다. 고체상 재접힘된 단백질은 자신의 생물학적 역가를 유지하였다. 따라서 이연구는 고체상 재접힘 방법이 분자간의 상호작용을 억제하여 응집현상을 현저히 줄였기 때문에 기인한 결과로 생각된다. 따라서 응집으로 인한 재접힘 수율이 낮은 단백질의 재접힘공정에 고체상 재접힘 공정을 사용하면 높은 재접힘 수율을 얻을 수 있다.

A fusion protein, consisting of a human epidermal growth factor as the recognition domain and human angiogenin as the toxin domain, can be used as a targeted therapeutic against breast cancer cells among others. The fusion protein was expressed as an inclusion body in recombinant E. coli, yet when the conventional solution-phase refolding process was used the refolding yield was very low due to severe aggregation, probably because of the opposite surface charge resulting from the vastly different pI values of each domain. Accordingly the solid-phase refolding process, which exploits the ionic interactions between a solid matrix and the protein, was tried, however the ionic binding yield was also very low regardless of the resins and pH conditions used. Therefore, to provide a higher affinity toward the solid matrix, six lysine residues were tagged to the N-terminus of the hEGF domain. When cation exchange resins, such as heparin- or CM-Sepharose, were used as the matrix, the adsorption capacity increased 2.5～3-fold and the subsequent refolding yield increased nearly 15-fold compared to the conventional process. A similar result was also obtained when an Ni-NTA metal affinity resin was used.

고체 상에 고정화된 단백질에 대한 풀림/재접힘 공정을 SPR을 이용하여 정량적으로 모니터링 할 수 있는 방법을 제시하였다. 이러한 방법은 고정화된 단백질의 재접힘 공정의 모니터링을 위한 현재까지 유일한 방법이며 생물학적 활성과 의 비교를 통해 논리적인 근거를 제시하였다. 그러나 이러한 센서칩 상에서 단백질의 풀림과 재접힘을 모니터링 하는 실험에서 풀림 정도에 따른 단백질의 생물학적 활성을 측정한 다는 것이 대부분의 단백질에서는 어려운 문제가 있다. 앞으로 생물학적 활성과 연관된 여러 대상 단백질에서 추가적인 연구가 필요하다. 그러나 본 연구 방법은 빠른 시간에 적은 시료만으로 실험을 수행할 수 있기 때문에 고체상 재접힘(solid-phase refolding) 공정의 최적 조건을 찾는 방법으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

The process monitoring method for the traditional solution-phase refolding could not be directly applied to the solid-phase refolding of immobilized proteins. In this study, we studied the structural change of the covalently immobilized proteins on the gold film of a SPR (surface plasmon resonance) sensor chip by detecting the reflective index change. After confirming the positive relationship between the resonance value and the protein's degree of unfolding, we tested the effect of denaturant concentration such as urea and guanidine-HCl on the protein structure. To investigate the effect of disulfide bonds on the refolded structure, 2 mM dithiothreitol was added during the in-vitro refolding experiment of urokinase (12 disulfides) and disulfide-free myoglobin. Unlike the myoglobin, the RU (resonance unit) value of the urokinase was not fully recovered to the original value, which suggested that the unrecovered RU value represent the miss-shuffled structure. We proposed the unique method to monitor the unfolding/refolding of immobilized proteins by using the simple SPR sensor. This method can be applied to identify the optimal condition for the solid-phase refolding process of immobilized proteins.

rhGH-GST 융합단백질을 사용하여 재조합 대장균 세포 파쇄액으로부터 직접적으로 내포체의 solid-phase 재접힘을 수행할 수 있는 새로운 공정을 개발하였다. 그것은 고체 입자를 제거하는 동시에 초기에 목적단백질을 흡착 포집할 수 있는 expanded bed adsorption 크로마토그래피의 장점을 이용한 것이다. 세포 파쇄액 내 용해된 내포체로부터의 풀린 융합단백질은 expanded bed adsorption 원리에 의해 STREAMLINE DEAE resin에 흡착되고 세포 찌꺼기 등 고체 입자물들은 위 방향 흐름에 의해 효과적으로 제거된다. Urea를 점차적으로제거함으로써 융합단백질은 고체 matrix 표면에서 재접힘 된 후 염 농도 구배에 의해 용출된다. 이 새로운 EBA-mediated 재접힘 방법은 응집현상을 획기적으로 줄이고 공정수율을 향상시킬 뿐 아니라 공정단계 수를 줄일 수 있다. 이 공정은 우리가 알고 있는 한 세계에서 최초로 개발된 공정이며, 현재 single-chain polypeptide, affinity-tagged protein 등과 같은 다른 형태의 단백질에 EBA를 사용한 재접힘 공정을 적용시 키기 위한 연구가 진행되고 있다.

To avoid the intrinsic problem of aggregation associated with the traditional solution-phase refolding process, we propose a solid-phase refolding method integrated with expanded bed adsorption chromatography. The model protein used was a fusion protein of recombinant human growth hormone and a glutathione S transferase fragment. It was demonstrated that the EBA-mediated refolding technique could simultaneously remove cellular debris and directly renature the fusion protein inclusion bodies in the cell homogenate with much higher yields and less aggregation. To demonstrate the applicability of the method, we successfully tested the three representative types of starting materials, i. e., rhGH monomer, washed inclusion bodies, and the E. coli homogenate. This direct and simplified refolding process could also reduce the number of renaturation steps required and allow refolding at a higher concentration, at approximately 2 mg fusion protein per ml of resin. To the best of our knowledge, it is the first approach that has combined the solid-phase refolding method with expanded bed chromatography.

Superoxide dismutase (SOD) removes damaging reactive oxygen species from the cellular environment by catalyzing the dismutation of two superoxide radicals to hydrogen peroxide and oxygen. Extracellular superoxide dismutase (EC-SOD) is a tetramer and is present in the extracellular space and to a lesser extent in the extracellular fluids. Increasing therapeutic applications for recombinant human extracellular superoxide dismutase (rEC-SOD) has broadened interest in optimizing methods for its purification, with a native conformation of tetramer. We describe a solid phase refolding procedure that combines immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and gel filtration chromatography in the purification of rEC-SOD from Escherichia coli. The purified rEC-SOD tetramer from the $Ni^{2+}$-column chromatography is refolded in Tris buffer. This method yields greater than 90% of the tetramer form. Greater than 99% purity is achieved with further purification over a Superose 12PC 3.2/30 column to obtain the tetramer and specific activities as determined via DCFHDA assay. The improved yield of rEC-SOD in a simple chromatographic purification procedure promises to enhance the development and therapeutic application of this biologically potent molecule.