Earticle

과학기술의 빠른 발전으로 생명공학이 이루어낸 가장 큰 성공 중의 하나가 인체치료용으로 사용할 수 있는 재조합단백질(바이오신약)을 생산할 수 있게 되었다는 것이고, 이러한 바이오신약분야는 바이오산업의 핵심분야로서 세계시장의 선점을 위한 기술 강대국들의 경쟁력이 가장 치열한 분야이다. 일반적으로 재조합체 단백질 생산에는 적합한 합성 기작을 가지고 있는 박테리아 및 세포들을 이용한 배양으로 생산하고 있으나, 이러한 목적에 잘 맞는 또 하나의 선택이 형질전환동물을 이용한 생체반응기(Bioreactor)이고, 산업적으로 이용할 수 있는 양의 재조합단백질을 세포배양이 아닌 유즙, 계란, 혈액, 오줌, 혈청 등 형질전환동물의 생체에서 생산하는 것이다. 이러한 연구개발의 첫 번째 목표는 형질전환기술을 이용하여 형질전환동물을 생산하는 것이며, 두 번째로는 개발된 형질전환동물 생체로부터 생산된 치료용 재조합단백질을 분리 정제하여 약리효능을 검증하고, 신약으로서의 유효성 평가를 하는 것이다. 지금까지 국내에서도 많은 연구자들이 이러한 목표를 향해서 형질전환동물들은 개발하였으나, 두번째 목표인 생산된 재조합체단백질을 분리 정제하는 기술이 부족하여 실용화에 걸림돌이 되고 있다. 본 연구팀도 유즙에서 재조합단백질을 생산하는 형질전환동물을 개발하였으며, 두 번째 연구목표를 달성하기 위해서 분만돼지 유즙을 채취하고 가공처리하는 유즙전처리공정을 개발하여 이를 통해 유즙에 들어있는 불순물들을 효과적으로 제거할 수 있는 기술을 구축하였고, 재조합체 분리정제단계에서는 초기 재조합체 회수율을 높이고자 친화성 결합체를 이용한 정제방법을 선택하였다. 또한, 고전적인 이온결합 및 소수성결합 정제방법등도 활용하여 재조합체를 분리정제를 시도하였으며, 앞으로는 정제산물에 대한 유효성평가를 통하여 형질전환동물이 생산한 재조합체 단백질에 대한 약리 약효성을 분석할 계획이다. 특히, 본 연구를 통하여 형질전환동물을 활용한 바이오신약개발에 대한 연구기반을 확립하고자 한다.

소에서 BCS는 영양관리를 평가하는 방법으로 이용되고 있으며, BCS 조건에 따라 번식 성적에 영향을 주며 난소활동 재개 지연 등의 현상을 초래하는 것으로 알려져 있다. 우리나 라에서 수정란 이식기술은 우수종축의 우수한 유전능력을 단기간에 확대 보급할 수 있는 방법으로 이용하고 있다. 수정란 이식 기술은 단기간에 다수의 수정란을 확보 할 수 있고, 우수한 종축의 능력을 증식 · 보존할 수 있는 기술로 전 세계적으로 이용하고 있는 기술이 다. 본 실험은 한우의 BCS별 체내수정란 회수율과 이식가능 수정란의 비율을 비교하였고, BCS별 채란일로부터 발정재귀까지의 기간을 비교 조사하였다. 본 실험은 국립 축산과학원 가축유전자원시험장에서 보유중인 한우 55마리를 공시하고, BCS 2.5 이하인 개체 8두, BCS 3.0인 개체 36두, BCS 3.5이상인 개체 11두, 세 그룹으로 구분하였다. 발정주기에 관계없이 CIDR를 질 내에 삽입하고, 4일 후부터 FSH(안토린) 28 AU를 12시간 간격으로 주사하고, FSH(안토린) 주사 3일째 CIDR을 제거함과 동시에 PGF2α (Lutalyse) 3 ml을 주사해 과배란을 유기하였다. 인공수정은 PGF2α(Lutalyse) 주사한 뒤 발 정 확인 후 12시간 간격으로 3회 실시하였다. 1차 인공수정 전 GnRH 1.0 ml을 주사하고, 수정란 회수는 1차 인공수정 후 8일째에 3-Way Catheter를 이용해 실시하였다. 발정재귀 확인은 채란 후 발정확인일까지의 날짜 수로 계산하였다. BCS 2.5 이하, 3.0, 3.5 이상 그룹에서 회수된 총 수정란 개수는 각각 44개, 363개, 87개 였으며, 평균 회수란의 개수는 각각 6.29±1.91개, 12.96±1.50개, 7.91±1.68개였다. 평균 이 식가능한 수정란의 개수는 각각 5.43±1.67개, 8.50±1.41개, 4.82±1.79개로 BCS 3.0인 집단 이 다른 그룹에 비해 높은 수정란 회수율과 이식가능 수정란 회수율을 보였다. 발정재귀일 까지 걸리는 기간은 각각 평균 28.40±1.94일, 22.38±4.02일, 19.22±6.76일로 나타나 유의 적 차이는 없는 것으로 보인다. 본 실험의 결과로부터 적절한 BCS는 체내수정란 회수시 수정란 회수율과 이식가능한 수 정란의 비율에 좋은 영향을 미치는 것을 알 수 있었으며, BCS와 채란 후 발정재귀일의 관 계는 집단 내 개체간의 차이가 큰 것으로 사료된다.

이종장기이식을 연구하는 많은 과학자들은 대부분 면역거부 반응 감소 연구에 초첨이 맞춰져 있다. 따라서, hyperacute rejection, acute humoral xenograft rejection, acute cellular xenograft rejection, chronic xenograft rejection과 같은 수용체(recipient)에서의 거부 반응 연구에 집중되어 있는 것이 현실이다. 본 연구에서는 이종에 이식된 심장 자체 또 한 큰 문제점이 발생할 수 있을 것으로 판단되어 연구를 수행하게 되었다. Cynomolgus monkey에 heterotopic 방법을 이용하여 α1,3-Galactosyltransferase 유전자 기능 제거 (GalT-KO) 돼지의 심장을 이종이식 하였다. 이식 후 약 9일간 생존한 원숭이로부터 심장 절편을 채취하여 next generation sequencing 방법을 통해 이종이식을 수행하지 않은 돼 지의 심장과 mRNA의 발현 차이를 분석하였다. 그 결과 이종이식 후 심장에서 심근경색 및 섬유증과 관련된 것으로 알려진 matricellular proteins (Thrombospondin1, Tenascine C, SPARC, Periostin 2C)의 transcripts가 급격히 증가하는 결과를 확인할 수 있었다. 이 러한 결과는 real-time PCR 방법을 이용하여 비교하였을 때, Thrombospondin 1의 경우, 7.183±0.4563배, Tenascine C는 37.67±3.525배, SPARC는 7.662±1.281배, Periostin 2C 는 2.482±0.5193배까지 mRNA의 양이 급격히 증가하는 현상을 재확인할 수 있었으며, 단백질 또한 조직염색을 통해 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다. 실제로 이종이식 심장 의 병리적 분석을 통해 심근경색 증상이 확인되었다. 결과적으로 이종장기 이식의 성공 을 위해서 수용동물에서의 면역거부 반응뿐만 아니라, 공여체인 돼지 심장 또한 여러 질 환에 노출되어지고 있으며, 그에 따른 대처가 반드시 필요할 것으로 판단된다.

혈액응고 제 8인자(FVIII)는 혈액 내 존재하는 당단백질의 하나로, 혈액응고의 내인성 기 작에 기능한다. 이러한 FVIII의 결핍은 A형 혈우병을 야기하는 것으로 알려져 있으며, A형 혈우병 환자는 FVIII의 지속적인 주사에 의해 치료되고 있다. 본 연구는 A형 혈우병의 치료 제로써 활용 가능한 B-domain이 변형된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자 (dB747)를 유즙으 로 분비하는 형질전환 돼지의 유즙으로부터 크로마토그래피적인 방법으로 dB747의 효율 적 인 정제를 위한 방법을 제공하기 위하여 수행되었다. 연구는 dB747을 유즙으로 발현하는 형질전환 돼지의 유즙을 착유하여 원심분리를 통해 지질과 불순물을 제거하고, 유즙 내 복 합적으로 존재하는 수 많은 단백질을 분획하기 위한 전처리 과정으로써 일반적으로 유즙 단백질을 침전시킨다고 알려진 zinc chloride, calcium chloride와 일반적인 단백질 침전에 널리 이용되는 ammonium sulfate를 농도 별로 처리하여 분획의 정도를 확인하였다. 전처 리 과정을 통해 분획된 유즙을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 방 법으로 정제하였다. 음이온 교환 크로마토그래피는 혈장 유래의 FVIII을 정제하는데 유리하 다고 알려진 Q sepharose FF 컬럼을 이용하여 대표적인 두 가지 sodium acetate와 sodium citrate buffer의 효과를 비교하였다. 또한, 친화 크로마토그래피는 B-domain이 결여된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자(BDDrFVIII)을 정제하는데 이용 가능하다고 알려진 펩타이드 TN8.2와 EYHSWEYC를 리간드로 사용한 컬럼을 제작하여 수행하였다. 그 결과, dB747이 포함된 형질전환 돼지의 유즙을 분획하기 위해서는 ammonium sulfate의 연속적인 처리를 통해 포화도 30%의 상층액을 회수하여 포화도 50%가 되도록 ammonium sulfate를 첨가하 였을 때 생성되는 pellet을 이용하는 것이 가장 효율적인 것으로 나타났다. 효율적인 전처리 과정을 거친 유즙을 이용한 크로마토그래피 결과, 혈장 유래의 FVIII의 정제에 대한 이전의 보고와는 다르게 dB747의 회수율과 순도가 낮았다. EYHSWEYC를 이용한 친화 크로마토 그래피의 경우, 알려진 것과는 다르게 dB747과 결합하지 않는 것으로 확인되었으며, TN8.2 를 이용한 친화 크로마토그래피 역시 dB747를 정제하는데 이용하기 어려웠다. 또한, 크로 마토그래피 용출액 내에 20～40 kDa의 단백질이 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 문헌 조사를 통해 카제인으로 유추할 수 있었다. 이러한 결과는 dB747이 B-domain 영역이 변형 되는 과정에서 기존의 FVIII 또는 BDDrFVIII과 단백질의 성질이 달라짐으로써 기존에 알려 진 정제 조건이 알맞지 않기 때문에 회수율과 순도가 낮았던 것으로 사료된다. 따라서 dB747의 성질을 이해하고 최적화된 크로마토그래피 조건을 확립하기 위한 연구가 필요할 것이다. 또한, 카제인과 같은 유즙 단백질이 크로마토그래피 용출액에서 나타나는 것으로 보아, 유즙 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피나 친화 크로마토그래피에 의해 제거되지 않음을 확인할 수 있었다. 그러므로 초기 전처리 단계에서 유즙 단백질을 제거하기 위한 방 법의 연구가 유즙 내 목적 단백질을 정제하는데 있어서 중요한 문제가 될 것이다.

돼지 핵이식 복제수정란의 체외 발달율을 개선하고자, 핵이 주입된 수핵난자를 전기자극 에 의한 융합 후 demecolcine으로 세포질 활성화 처리를 실시하였다. 2-세포기로 분할 전 까지 핵의 이상분열을 억제하여 정상적인 핵형 유지여부 및 demecolcine이 핵의 방출을 유 도하여 탈핵의 전 처리, 핵이식 후 활성화의 후 처리 및 탈핵 전․후 처리를 모두 한 핵이 식 수정란의 체외발달율을 조사하였다. 융합이 이루어진 복제 수정란에 demecolcine을 4시간 처리하였을 때 정상적인 핵 모양인 CLC(clustered chromosomes) 상태는 43.2%로서 무 처리구의 15.0%보다는 높았으며, 1PN (single pronucleus) 상태는 46.9%로서 대조구의 35.0%와는 차이가 없었다. 비정상적인 핵 형인 ≥2PN, PPB+CLC or PN 및 ≥2PN 7.4, 0 및 2.5%로서 무 처리구의 17.5, 22.5 및 10%로서 처리구가 낮았다. 융합 이후 16시간에는 1PN이 85.0%로서 대조구의 56.7%보다 는 높았다. 분할율은 전․후 모두 처리구에서 86.4±2%로서 후 처리(81.3±6%)와 대조구(79.6±6%) 보 다 높았으며, 전 처리의 85.7±2%와는 차이가 없었다. 배반포기로의 발달율에 있어서도 전․후 처리가 18.1±3%로서 전 처리(11.0±3%)와 대조구(11.3±1%)에 비하여 높았으나, 후 처리의 15.5±1%와는 차이가 없었다. 배반포기 수정란의 할구수도 전․후 처리가 21.6±6% 로서 전, 후 처리 및 대조구의 각각 18.8±8%, 19.4±3% 및 19.7±2%보다 많았다. Demecolcine을 돼지 복제 수정란에 처리하면 분할 전까지 핵의 이상 분열을 억제하는 것 이 확인되었으며, demecolcine 처리에 의한 탈핵은 수핵난자의 세포질 손상을 감소시키고 보다 용이하게 할 수 있다. 본 연구에서와 같이 탈핵 및 활성화를 목적으로 탈핵 전․후 처 리를 하였을 때 체외발달율이 다소 개선되는 경향을 보였다.

A형 혈우병은 혈액응고 제 8인자(FactorVIII: FVIII)가 유전적으로 결핍되어 나타나는 희귀병이며, FVIII인자는 내인성 혈액응고반응에 필수적으로 필요한 당단백질이다. 이러한 A형 혈우병 환자는 FVIII의 지속적인 주사에 의해 정상적인 혈액응고반응이 일어나고 생명연장이 가능하다. 본 연구는 인간 혈액응고 제 8인자 단백질영역 중 B-domain을 변형시킨 재조합체(FVIII-dB747)를 유즙으로 분비하는 형질전환 돼지의 후대를 계획적으로 종부시키면서 생산되는 형질전환돼지의 유즙으로부터 FVIII-dB747의 효율적인 정제를 위한 방법을 제공하기 위하여 수행되었다. 분만돈에 옥시토신을 투여하여 FVIII-dB747을 발현하는 유즙을 채취하여 원심분리를 통해 지질과 불순물을 제거하고, 유즙 내 복합적으로 존재하는 수 많은 카제인 단백질을 분획하기 위한 전처리 과정을 실시함으로써 분획의 정도를 확인하였다. 또한 전처리 과정을 통해 분획된 유즙을 이용하여 음이온 교환수지와 친화성 크로마토그래피 방법으로 FVIII-dB747의 정제를 시도하였다. 음이온 교환 크로마토그래피는 인간 혈장 유래의 FVIII을 정제하는데 사용되어지는 Q sepharose FF 컬럼을 이용하여 pH변화에 따른 분리도를 비교하였다. 또한 친화성 크로마토그래피는 B-domain이 결여된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자(BDD rFVIII)을 정제하는데 이용 가능하다고 알려진 단일항체 리간드로 사용한 컬럼을 사용하여 수행하였다. 그 결과, 기존의 ammonium sulfate침전법을 이용한 침전방법보다는 간단하면서 효과적인 전처리 분획방법으로 개선되었으나, pH 변화에 따른 이온교환 수지를 활용한 분리법에서는 카제인 단백질이 FVIII-dB747이 포함된 분획과 함께 유출되는 현상이 발생되었다. FVIII-dB747 형질전환돼지의 유즙을 이온교환 수지로 분리할 경우 전처리과정 중 카제인 단백질을 제거하기 위한 ultra-filteration이 필요한 것을 알 수 있었다.

Membrane cofactor protein(MCP)은 세포막에서 발현하는 보체 조절 단백질로서, 보체 부산물인 c3b, c4b 등을 불활성화시킴으로써 항원-항체 반응과 염증반응을 억제하는 역 할을 한다. Thrombomodulin(TBM)은 protein C를 활성화시켜 혈액응고를 억제시키는 기 능을 수행하는 단백질로서 높은 수준으로 발현되면 번식장애를 유도한다고 알려져 있다. 그런데, MCP cDNA를 이용한 발현벡터를 세포에 도입하면 mRNA 수준에서는 효율적으 로 과발현이 유도되나, 단백질로 발현되는 수준이 낮아, MCP는 과발현 유도가 어려운 유전자로 알려져 있다. 본 연구에서는 MCP cDNA의 전사체로부터 번역되는 효율이 낮아 단백질 발현 수준이 낮은 것으로 판단하여, 아미노산 서열의 변경은 없이 cDNA 유전자 서열을 치환, 변경하면 단백질 발현 수준이 증가하는지 분석하였으며, 동시에 TBM 발현 수준을 연결한 프로모터로 조절이 가능한지 분석하였다. 이를 위해 CAG 프로모터에 염 기서열을 치환한 MCP cDNA와 2A 시스템을 활용한 TBM cDNA를 연결한 발현 벡터 (CAG-pmMCP_2A_TBM)와 CAG 프로모터에 염기서열을 치환한 MCP cDNA와 돼지 Icam- 2 프로모터에 TBM cDNA를 연결한 발현벡터(CAGpmMCP-pI2TBM)를 각각 제작한 후 porcine ear fibroblast(pEF), porcine aorta endothelial cell(pAEC)에 도입하였다. pEF 세 포와 pAEC에서 CAG-pmMCP_2A_TBM 벡터는 대조군에 Flow cytometry로 분석한 단백 질 수준에서는 염기서열 치환에 의해 MCP 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였 고, pAEC에서 TBM 발현 수준은 돼지 Icam2 프로모터가 CAG 프로모터보다 높아 프로 모터의 선정으로 발현 수준을 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 단백질로 과발현된 MCP가 보체 활성화 억제 기능을 수행하는 지 알아보기 위하여, 발현벡터가 도입된 pEF 세포에 정상 cynomolgous monkey 혈청을 첨가하여 cell proliferation assay를 수행한 결 과 세포 사멸이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 MCP cDNA의 염 기, 서열 변경을 통해 보체 활성 억제 기능을 효율적으로 수행하는 단백질의 과발현을 유도할 수 있으며, 프로모터의 선정으로 세포나 동물의 생리에 유해한 해를 끼치는 유전 자의 발현 수준 조절이 가능하다는 것을 보여준다.