Earticle

독소루비신 생합성 유전자의 발현을 촉진시키는 유전자인 dnrI와 다나루비신으로부터 독소루비신으로의 생전환에 관여하는 유전자인 doxA를 ermE* 프로모터가 포함된 pSE34에 도입하였을 때 각각 5.5배, 2.5배의 독소루비신 생산성 증가가 이루어졌다. 독소루비신 생합성 유전자군의 발현패턴 분석을 위한 DNA microarray system을 구축하였고, 고생산 균주의 독소루비신 생합성 유전자 발현 패턴을 DNA microarray를 통해 확인하였다. 독소루비신 생합성 유전자군의 세포성장에 따른 발현패턴을 분석한 결과, 독소 루비신 생산성 증가에 따라 생합성 유전자의 발현도 증가함을 확인할 수 있었고, pSE34를 통해 도입해준 doxA, dnrI 유전자의 경우 전체 생합성 유전자의 평균보다 높은 수준의 발현량을 보여줌으로써, ermE* 프로모터에 의해 발현이 극대화되었음을 확인할 수 있었다. 독소루비신 내성 유전자의 경우 다른 독소루비신 생합성 유전자들에 비해 발현정도가 크게 증가했고, DnrI에 의해 조절을 받는 다른 유전자들의 발현 수준과 비교하였을 때 TDP-daunosamine을 생합성의 첫 번째 단계에 관여하는 dnmL 유전자는 그 발현양의 증가가 크지 않았다. 따라서 DNA microarray 시스템 분석 결과, 독소루비신 생산성 극대화를 위해서는 dnrI, doxA, drrA, drrB, drrC, dnmL 등의 유전자들의 안정적 발현이 매우 중요하고도 핵심적인 인자임이 확인되었다.

Doxorubicin is an anthracycline-family polyketide compound with a very potent anti-cancer activity, typically produced by Streptomyces peucetius. To understand the potential target biosynthetic genes critical for the doxorubicin overproduction, a doxorubicin-specific DNA microarray chip was fabricated and applied to reveal the growth-phase-dependent expression profiles of biosynthetic genes from two doxorubicin-overproducing strains along with the wild-type strain. Two doxorubicinoverproducing S. peucetius strains were generated via over-expression of a dnrI (a doxorubicin-specific positive regulatory gene) and a doxA (a gene involved in the conversion from daunorubicin to doxorubicin) using a streptomycetes high expression vector containing a strong ermE* promoter. Each doxorubicin-overproducing strain was quantitatively compared with the wild-type doxorubicin producer based on the growth-phase-dependent doxorubicin productivity as well as doxorubicin biosynthetic gene expression profiles. The doxorubicin-specific DNA microarray chip data revealed the early-and-steady expressions of the doxorubicin-specific regulatory gene (dnrI), the doxorubicin resistance genes (drrA, drrB, drrC), and the doxorubicin deoxysugar biosynthetic gene (dnmL) are critical for the doxorubicin overproduction in S. peucetius. These results provide that the relationship between the growth-phase-dependent doxorubicin productivity and the doxorubicin biosynthetic gene expression profiles should lead us a rational design of molecular genetic strain improvement strategy.

방선균은 그람 양성 토양 미생물로서 다양한 형태적 변 형 및 생리학적 분화를 갖는 생물학적으로 매우 매력적인 미생물로 알려져 있다(1). 또한 산업적으로도 매우 유용한 항생제, 항암제, 면역억제제와 같은 다양한 2차 대사산물 을 생산하여, 인간 및 동식물의 질병 치료에도 꾸준히 사 용되어 왔다(2, 3). 최근 방선균에 대한 연구 패러다임은, 우선 신규 방선균 종 동정 및 유용 생리활성 물질을 분리 하여 그에 따른 생합성 유전자를 분리하고(4, 5), 방선균 의 전체적인 대사 조절 기작에 대한 연구결과를 접목시킴 으로써 궁극적으로는 보다 다양한 유용 신규 생리활성 물 질의 분리 및 생산성 향상을 도모하고자 하는 방향으로 진화하고 있다(6, 7). afsR2는 S. lividans 유래 조절유전자이며, actinorhodin (ACT), undecylprodigiocin (UND)의 항생제 생합성을 증가 시키는 것으로 알려져 있으며(8), S. coelicolor 조절 유전자 인 afsS와는 염기서열상 동일하며 AfsK-AfsR-AfsR2 (AfsS) two-component 시스템으로 상위 조절 기작이 비교적 잘 규명되어 있는 실정이다(9). 하지만 많은 연구에도 불구하 고 AfsR2가 어떤 기작을 통해서 항생제의 생합성 증가에 관여하는지는 아직 밝혀지지 않은 상태이다. AfsR2가 과 발현 되었을 때, pathway-specific 조절 유전자들의 발현 이 증가되는 것이 확인된 바 있으나 이것이 AfsR2의 direct-interaction에 의한 현상인지는 확인되지 않았다(10) 또한 afsR2가 존재하지 않는 외래 방선균에서 AfsR2를 발현시켰을 때 해당 방선균의 항생제 생합성이 증가한다 는 연구보고는 AfsR2가 단지 pathway-specific 조절유전 자의 발현에만 관여하는 것이 아니라 보다 많은 기능을 가지고 있음을 암시하고 있다(11, 12). 현재까지 AfsR2의 down-steam 조절기작을 규명하기 위하며 많은 연구가 진행되어 왔으며, 이전 연구에서 afsR2 염기서열 분석을 통해 3개의 α-helixes를 포함한 sigma factor의 domainⅢ에 해당하는 sigma-like 기능을 보고한 바 있으며, RNA polymerase의 결합과 관련된 sigma factor 로서의 가능성도 제시되었다(13). 또한 AfsR2 과발현 균주 를 이용하여 2D electrophoresis 연구에서는 AfsR2의 과발 현이 phosphate starvation과 관련된 단백질 발현을 촉진한 다는 결과가 보고된 바 있다(14). 특히 최근에는 S. coelicolor 유래의 afsR2 null mutant를 이용한 마이크로어레이 연구 결과, AfsR2가 phosphate starvation과 관련된 유전자들의 발현에 관여함으로써 nutritional starvation stress를 줄여 주는 것으로 예측되었고, 또한 ECF-sigma factor의 발현과 도 밀접한 관련이 있으며 하나 이상의 sigma factor가 발현 하는데 필요한 linker로서의 가능성도 제시되었다(15). 본 연구에서는 afsR2 조절유전자의 기능적 역할을 탐색 하고자 afsR2 과발현 S. lividans 균주를 이용하여 마이크 로어레이 연구를 수행하였다. 이는 기본적으로 유전자들의 발현이 저하되어 있는 S. lividans에서 afsR2의 기능을 관찰 하기 위한 적절한 방법으로 유전자들의 발현이 활성화 되 어있는 S. coelicolor의 afsS null mutant를 이용한 연구와 상호 보완적인 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단되었다. 본 연구를 통해서 AfsR2를 과발현 하였을 때, 기존에 알려진 phosphate starvation 관련 유전자들과 일부 ECF-sigma factor 들의 과발현을 재확인하였으며, 더불어 형태적 분화와 관련 있는 whi 관련 유전자와 ACT 생산과 밀접한 관련이 있는 abaA-like pleiotrophic regulatory gene의 발현과도 관련이 있음을 추가적으로 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구결과 를 토대로 afsR2가 방선균 내에서 2차 대사산물의 조절기작 및 생합성에 매우 중요한 key-factor 역할을 담당하고 있음 을 제시할 수 있었다.

AfsR2 in Streptomyces lividans, a 63-amino acid protein with limited sequence homology to Streptomyces sigma factors, has been known for a global regulatory protein stimulating multiple antibiotic biosynthetic pathways. Although the detailed regulatory mechanism of AfsK-AfsR-AfsR2 system has been well characterized, very little information about the AfsR2-dependent down-stream regulatory genes were characterized. Recently, the null mutant of afsS in S. coelicolor (the identical ortholog of afsR2) has been characterized through DNA microarray system, revealing that afsS deletion regulated several genes involved in antibiotic biosynthesis as well as phosphate-starvation. Through comparative DNA microarray analysis of afsR2-overexpressed S. lividans, here we also identify several afsR2-dependent genes involved in phosphate starvation, morphological differentiation, and antibiotic regulation in S. lividans, confirming that the AfsR2 plays an important pleiotrophic regulatory role in Streptomyces species.

Pathogen detection is an important issue due to the threats posed by severe communicable diseases. Here, to achieve multiple detection of 11 selected pathogens, we constructed a 16S rDNA chip. Although 7 target pathogens were specifically detected using PCR labeling method, some target species or subtypes were difficult to discriminate due to nonspecific binding. Therefore, a pattern-mapping statistical model was established using an artificial neural network algorithm. The pattern-mapping tool combined with the DNA chip resulted in successful detection of all target pathogens. In addition, to reduce the intrinsic bias and extended time and effort induced by PCR or labeling reaction, we suggested direct detection method using 16S rRNA as target. The bacterial total RNAs from cell lysate were hybridized to constructed 16S rDNA-based chip and detected using 7 fluorescent-labeled detector probes. The direct detection combined with the DNA chip resulted in more specific detection of all target pathogens than that of PCR labeling method. Collectively, our novel pattern-mapping tool and 16S rRNA direct detection combined with a 16S rDNA-based chip are a simple and effective method for detecting multiple pathogens.

Genomics-guided technologies including cDNA microarrays have been successfully applied for the identification of gene expression alterations in various Streptomyces strains. To detect global changes in mRNA abundance associated with overproduction of anti-cancer doxorubicin, reverse engineering strategy via comparative transcriptome analyses in cultures of the wild-type and industrial mutant strains of S. peucetius were conducted using interspecies S. coelicolor cDNA microarrays. Among 160 S. coelicolor potential candidate genes showing at least a two-fold change in transcription profile, a SCO3579 (whiB-like gene named wblA) inhibited the biosynthesis of doxorubicin in S. peucetius as well as the production of antibiotics in S. coelicolor, suggesting that wblA and its homologs act globally among streptomycetes as down-regulators of antibiotic biosynthesis. In addition, one of tetR-family transcriptional regulatory genes was also identified to encode a global antibiotic regulator. Gene disruption of S. coelicolor revealed that this tetR-family regulatory gene down-regulates antibiotic biosynthesis through pathway-specific regulators even in the presence of the wblA transcript, implying that it might encode a wblA-bypassing antibiotic down-regulator. To isolate and manipulate a wblA homolog in a doxorubicin-overproducing S. peucetius industrial stain, a total genomic DNA library from a S. peucetius industrial mutant was constructed and screened using a S. coelicolor wblA as a probe, resulting in isolation of a wblA ortholog (wblA-spe) showing 95% amino acid identity to a S. coelicolor wblA. Gene disruption of wblA-spe from the S. peucetius industrial mutant resulted in additional increase of doxorubicin production, implying that doxorubicin productivity in the S. peucetius industrial mutant strain could be further improved via rational comparative transcriptomics-guided target gene manipulation.

The analysis of DNA microarray data is a rapidly evolving area of bioinformatics, and various types of microarray are emerging as some of the most exciting technologies for use in biological and clinical research. In recent years, microarray technology has been utilized in various applications such as the profiling of mRNAs, assessment of DNA copy number, genotyping, and detection of methylated sequences. However, the analysis of these heterogeneous microarray platform experiments does not need to be performed separately. Rather, these platforms can be co-analyzed in combination, for cross-validation. There are a number of separate laboratory information management systems (LIMS) that individually address some of the needs for each platform. However, to our knowledge there are no unified LIMS systems capable of organizing all of the information regarding multi-platform microarray experiments, while additionally integrating this information with tools to perform the analysis. In order to address these requirements, we developed a web-based LIMS system that provides an integrated framework for storing and analyzing microarray information generated by the various platforms. This system enables an easy integration of modules that transform, analyze and/or visualize multi-platform microarray data.

DNA microarray is a high-throughput biomedical technology that monitors gene expression for thousands of genes in parallel. The abundance and complexity of the gene expression data have given rise to a requirement for their systematic management and analysis to support many laboratories performing microarray research. On these demands, we developed Xperanto for integrated data management and analysis using user-friendly web-based interface. Xperanto provides an integrated environment for management and analysis by linking the computational tools and rich sources of biological annotation. With the growing needs of data sharing, it is designed to be compliant to MGED (Microarray Gene Expression Data) standards for microarray data annotation and exchange. Xperanto enables a fast and efficient management of vast amounts of data, and serves as a communication channel among multiple researchers within an emerging interdisciplinary field.