Earticle

국내의 말 산업 확대와 승마인구 저변확대에 따른 승용말 생산의 필요성이 대두되고 있으나, 현재 대부분의 승용말은 경주 퇴역마 또는 고가의 수입말을 활용하고 있다. 따라 서 우수하고 경제적인 승용말의 국내 생산이 필요하며, 이에 따른 인공수정 및 수정란이 식 연구가 필요하다. 본 연구에서는 국내 환경에 적합한 말의 수정란 채란 및 이식 체계 를 확립하기 위하여 수행하였다. 공란말 및 수란말의 발정동기화는 초음파를 이용 난소검사 후 황체와 난포가 확인된 개체에 대하여 PGF2a를 근육주사 하였다. 발정이 확인된 개체는 난포크기를 측정하였고, 4 cm 이상에 도달하였을 때 배란유도 및 인공수정을 실시하였다. 수정란의 채란은 Equine Lavage Catheter (Bioniche, USA), 회수용 채란액은 ViGRO(Bioniche, USA)를 이용하 여 인공수정후 5, 6, 7 및 8일째에 실시하였다. 채란된 수정란은 5% FBS가 첨가된 TCM- 199에서 38.5℃, 5%CO2 하에서 배양하면서 크기를 조사하였다. 공란말 8두에 발정동기화를 유도하여 6(87.5%)가 발정이 유도 되었고, 6두가 배란유도 및 인공수정에 성공하였다. 인공수정 공란말 중 5두가 채란에 이용되어 3(60%)두가 채란 에 성공하였다. 채란된 수정란은 수정 후 배양 5일째 220 μm, 6일째 580 μm, 7일째 1.2 mm 및 8일째 2.2 mm로 발달한 후 부화하였다. 한편 채란된 7일째 수정란 2개를 수란말 2두에 이식하여 1두가 임신에 성공하였다. 한편 공란말의 혈중 프로제스테론 및 에스트 로젠 농도는 각각 평균 7.91 ng/ul 및 24.45 pg/ul이었고, 수란말의 혈중 프로제스테론 및 에스트로젠 농도는 각각 평균 16.06 ng/ul 및 49.13 ng/ul였다. 본 연구를 통하여 국내에서도 말의 수정란 채란 및 이식에 성공하여 번식기술을 활용 한 말의 증식 및 개량이 가능할 것으로 생각된다.

칡소의 고유유전자표현형 방식은 E+/E+와 E+/e 2개의 유전자형만이 출현하고, e/e 유 전자형을 가지는 개체는 전혀 출현하지 않아 제주재래흑우에서와 같이 흑색 호반모가 발 현되기 위해서는 기본적으로 E+ allele이 필요한 것으로 보고됨에 따라 본 연구는 수정란 이식 기법을 이용한 울릉칡소 특화단지 조성 연구용역에 의해 생산되어진 칡소의 모색발 현의 현황에 대해 조사하여 칡소의 우량유전자원의 선발과 증식을 통하여 칡소의 고정과 복원을 위해 실시되었다. 조사에 공시한 칡소는 2007년 수정란 이식 기법을 이용한 칡소 울릉특화단지 조성 연 구용역에 의해서 생산되어진 칡소를 대상으로 실시하였으며, 수정란 이식 후 임신 5-6개 월에 울릉관내 농가에 입식된 한우에서 생산된 칡소(이하 입식우) 159두와 울릉도 관내 의 한우에 칡소 수정란을 이식하여 생산된 칡소(이하 관내이식) 117두를 조사 대상으로 공시하였다. 먼저 울릉칡소의 모색 분포는 황모 24.3%(67/276두), 흑모 13.0%(36/276두) 와 호반모 62.7%(173/276두)의 분포를 보였으며, 입식우의 호반모 출현율이 66%(105/ 159두)로 관내이식에 의해 생산된 칡소의 호반모 비율 58.1%(68/117두)보다 다소 높은 경향이었으며, 성별에 따른 모색의 분포를 조사한 결과 수컷의 경우 황모의 비율이 18.1 %(25/ 138두)로 암컷의, 31.4%(43/137두)에 비해 출현율이 낮은 반면 호반모의 비율은 68.1% (94/138두)로 암컷의 56.9%(78/137두)에 비해 다소 높게 나타났다. 을릉도 칡소 모색 분포에 따른 조사를 바탕으로 비경의 흑반점의 강약에 따른 호반모 의 발현 양상을 분석한 결과 비경에 흑반점이 강한 개체들 중 호반모의 발현 정도를 분 석한 결과 호반모 1, 호반모 2, 호반모 3, 호반모 4, 호반모 5의 비율이 각각 2.3% (3/ 109), 24.8%(27/109), 43.1%(47/109두), 19.3%(21/109두), 10.1%(11/109두)로 나타났으며 흑반점이 중인 개체는 각각 7.9%(3/38), 52.6%(20/38), 34.2%(13/38두), 5.3%(2/38두), 0 %(0/38두)로 나타났다. 또한, 흑반점이 약한 개체는 각각 42.5%(17/40두), 45%(18/40두), 7.5%(3/40두), 0%(0/40두), 5%(2/40두)로 나타났다. 이 결과로 미루어 볼 때 비경에 있는 흑반점의 강약이 호반모 발현에서 황모와 흑모의 비율에 영향을 미치는 것으로 판단된다.

본 연구는 alpha 1,3-galactosyltrasfersase 유전자 기능 제거 돼지(GT KO)의 심장을 이 식 한 후 9일째 사망한 원숭이에서 사망의 원인을 추적하고자 실시하였다. 사망한 심장 의 조직을 병리학적으로 분석한 결과, 초급성 및 급성 거부반응의 징후는 발견되지 않았 고, 대표적인 심장질환의 하나인 심근경색과 심근 섬유증이 심장 전체에 광범위하게 발 견되었다. 이종이식에 의해 변화된 유전자의 발현 양상을 알아보기 위하여 동결 보존된 심장의 심실에서 총 RNA를 추출한 후 new generation sequencing을 실시하였다. 심장이 식에 활용한 돼지와 한 복으로 태어난 돼지의 심장을 이종이식일에 채취하여 대조군으로 사용하였다. 차등발현 유전자 데이터를 DAVID 분석을 실시하여 26개의 유의한 생물학적 경로 관련 유전자에서 발현 변화가 크다는 것을 알 수 있었다. 그 중에서 발현 변화 정 도가 높았던 경로는 심장질환 환자에서 빈번하게 발견되는 비대 심장근육증(hypertrophic cardiomyopathy), Valine, leucine and isoleucine degradation, 확장 심장근육증(Dilated cardiomyopathy), 부정맥유발 우심실 심장근육증(Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy) 이었다. KEGG를 통한 기능별 분석을 실시하여 심장근육증 관련 SGCA, SGCB, SGCD, SGCG, MYH6, MYH7, MYBPC3, and TNNI3, DMD 유전자의 유의적인 발현 감소를 발견하였다. 심장근육증의 대표적인 증상인 심근섬유증 진단 마커로 활용되 는 α-SMA, COL1A1, COL1A2, POSTN, VIM P4HA1, P4HA3, THY1, NPPA, NPPB 유전 자의 발현이 유의적으로 증가하였고, MYH6의 발현은 유의적으로 감소하는 것을 quantitative PCR 방법으로 검증하였다. 또한 심근 경색 관련 matricellular 단백질 유전자인 THBS1, TN-C, SPARC, POSTN의 유의적인 발현 증가를 quantitative PCR 방법과 면역 조직염색 방법으로 검증하였다. 이러한 결과로 GT KO 돼지의 심장을 이식받은 원숭이가 9일째 사망한 원인은 거부반응이 아닌 병리 및 생리적 이상에서 발생하는 심근경색 및 심근 섬유증에 의한 심장 근육의 이상으로 판단된다.

한우개량에 있어서 수정란이식 방법은 종전의 종모우의 능력치에 의존한 개량보다 선발의 강도 가 월등히 높기 때문에 현재 과배란 처리 및 OPU(Ovum pick up) 기법에 의한 수정란 생산 및 이식이 활발히 진행되고 있다. 하지만 아직까지 수정란 이식의 수태율은 약 40% 정도로 일반 인 공수정(약 60%) 수태율에 비해서 성공확률이 낮은 경우가 대부분이며, 관련된 비용과 절차(공란 우 선발, 수정란 생산, 이식, 수란우 관리) 등에 있어서 인공수정보다 상대적으로 많은 주의를 요 한다. 그리고 한우 수정란 이식에 관련된 많은 연구결과를 보면 수정란 질적요인, 시술자 숙련도, 수란우 상태 등이 수태율과 가장 밀접한 연관성을 가지고 있는 것으로 보여진다. 본 연구에서는 수정란 이식 수태율에 연관된 부분 중 수란우 특성 및 상태에 따라서 수태율간의 연관성을 분석하였다. 공시축은 포항축산농협 한우개량사업소에서 사육중인 1산차 암소를 대상 으로 실시하였으며, 수정란은 농협중앙회 경제지주(주) 한우개량사업소에서 공급받은 과배란 처 리방법(체내수정)에 의해 만들어진 냉동란을 사용하였으며, 실험결과의 오차를 최소화하기 위해 서 1명의 시술자가 배란동기화 처리 후 수정란을 이식하였다. 총 25두의 수란우에 수정란을 이식하였으며 평균 수태율은 48.0%였다. 수정란 이식당시 암소 의 월령별 수태율을 분석한 결과 21~25개월의 암소에서 수태율이 75.0%로 가장 높게 나타났다. 또한 수정란 이식 전 수태당 인공수정 횟수에 따른 수태율을 비교한 결과, 2회 이하인 경우, 수태 율이 56%로 2회 초과한 경우보다 높게 나타났다. 수란우가 분만 후 이식하기까지의 경과일수에 따른 수태율을 분석한 결과 51~80일 사이의 구간에서 가장 높은 수태율 77.8%을 확인 할 수 있 었다(p<0.05). 초음파 임신진단기를 활용한 이식 1일전 황체반응 검사를 실시하였으며 난소의 크 기(1.5 cm)에 따라 2개의 그룹으로 분리(A: 1.5 cm 이상, B: 1.5 cm 미만)하여 수태율을 비교한 결과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 따라서 수란우는 1산차 이상, 생후 21~25개월령, 수태당 수정횟수 2회 이하, 분만 후 경과일수 51~80일령인 개체를 선발하는 것이 수정란이식에서 보다 높은 수태율을 확인할 수 있을 것으로 기대된다. 하지만 실제로 한우농가에서 이와 같은 수란우를 확보하는 것은 상당히 어려운 실정임 으로 간단한 처리로 수태율 향상에 기여할 수 있는 실용화 연구가 필요하다고 생각된다. 최근 소 의 수정란 체외배양에 있어서 생리활성물질(resveratrol, trolox, linoleic acid, 기타 식물추출물 등) 의 처리에 따라 난성숙과 배발달에 긍정적인 영향을 미친다는 보고들이 있다. 따라서 in vitro 실험 에서 검증된 생리활성물질을 처리하고 임신관련 호르몬(progesterone, estradiol-17β)들의 변화와 수태율을 확인함으로써 생리활설물질을 통한 한우 암소의 수태율 향상기술 개발연구를 진행하고 자 한다.

본 연구는 한우 번식우의 수정란 이식 시, 최근 개발되어 보급된 심부주입기의 수태율 증진 효과를 검증하고자 수행되었다. 대조군에 사용된 주입기는 현재까지 사용된 일반적 인 주입기(ET syringe, IMV)이며 실험군에 사용된 심부주입기는 2가지 형태의 주입기 (Telescopic syringe, IMV / ET gun, FHK)를 사용하였다. 수정란 이식 수태율 분석에 이 루어진 수정란이식은 2015년부터 2018년 5월까지 이루어진 결과를 이용하였으며 체외수 정란은 신선란과 동결란을 모두 사용하였다. 체외수정란의 생산은 도축장에서 도축된 암 소의 난소를 실험실로 운반하여 실험에 이용하였으며 체외성숙은 FSH 0.5 ug/mL, LH 5 ug/mL, 0.125% BSA가 첨가된 TCM199 배양액에서 22시간 동안 38.5℃, 5% CO2의 조건 에서 배양되어 이루어졌다. 체외수정은 선별된 성숙난자를 1×106 /mL의 정자농도를 사용 하여 체외수정을 유도하였으며 mTALP 배양액에서 21시간동안 38.5℃, 5% CO2의 조건 에서 배양되어 이루어졌다. 발달배양은 mSOFaa 배양액을 사용하여 38.5℃, 5% CO2, 5% O2의 조건에서 최대 9일간 이루어졌다. 수정란 이식은 7, 8일차의 체외수정란을 발 정발견 후 7, 8일째의 수란우에 이식하였다. 실험결과, 대조군, 심부 IMV 및 심부 FHK에 서 이식 후 수태율이 32.9±7.2b, 52.3±7.3a 및 20.8±4.7c로 조사되었으며 유의적으로 심부 FHK를 사용한 결과가 높게 관찰되었다(p<0.05). 체외수정란의 7일차, 8일차 구분에 따른 이식 후 수태율은 대조군, 심부 IMV, 심부 FHK에서 각 31.1±4.4 및 33.0±1.2, 52.5±5.7 및 52.1±1.3, 19.7±7.0 및 21.7±6.7로 확인되었으나 유의적인 차이는 발견되지 않았다(p< 0.05). 신선란과 동결란의 비교결과는 심부 IMV 처리군은 동결란의 이식결과가 부족하고 심부 FHK 처리군은 신선란의 이식결과가 부족하여 분석하지 못하였다. 결론적으로 본 연구는 심부주입기의 수태율 증진효과를 검증하고자 수행되었으며, 조사결과 ET gun 심 부주입기(FHK)가 유의적으로 증가된 수태율을 보여주었으며 Telescopic 심부주입기(IMV) 는 오히려 일반적인 형태의 주입기보다 감소된 수태율을 보여주었다. 이러한 결과와 본 연구자의 경험을 바탕으로 ET gun이 시술과정에서의 편리함과 수태율 증진에 효과가 있 다고 판단이 되지만 기기를 다루는 시술자의 숙련도에 의한 영향이 큰 점을 고려해야만 할 것이다. Telescpic 심부주입기(IMV)는 수정란 주입이 2단계로 작동하는 조작의 불편함 이 있으며 수정란이식 시술에 3가지의 1회성 소모품을 매번 장착과 제거해야 하는 번거 로움이 있으며 소모품의 비용 또한 값비싸 현장에서 사용하기에 일반적인 형태의 주입기 와 ET gun에 비하여 적합하지 않다고 판단된다.

산소소비량은 수정란이식 수태율에 영향을 미치는 여러 요인들 중 하나인 수정란의 품 질을 판정할 수 있는 기준으로 알려져 왔다. 최 등(2010)은 한우 체내수정란의 형태학적 인 등급에 따른 산소 소비량을 비교, 체외수정란의 산소 소비량과 총세포수의 상관관계 를 확인한 결과, 국제수정란이식학회(International Embryo Transfer Society, IETS)에서 규정하고 있는 수정란의 등급 판정 기준에 준하여 형태학적 등급이 좋을수록 수정란의 산소 소비량도 높아지고, 체외수정란의 산소 소비량에 따른 총 세포수와 산소 소비량 사 이에도 정의 관계가 있다고 보고 했다. 따라서, 본 연구는 수정란의 산소 소비량을 측정 하여 그 품질을 확인하고, 이를 바탕으로 체내수정란의 산소 소비량이 수태율에 미치는 영향을 구명하고자 수행하였다. 한우 체내수정란의 생산은 난소 및 자궁질환이 없는 건 강한 한우 공란우를 과배란을 유기하여 3 way Foley catheter를 이용하여 수정란을 채란 하였다. 체외수정란은 국립축산과학원 가축유전자원시험장 관행방법을 기준으로 생산하 여 시험에 사용하였다. 수정란의 산소 소비량 측정은 수정란 호흡장치(FHK, HV-405, Japan)를 이용하였고, 수정란 호흡 장치는 주사형 전기화학현미경(Scanning Electrochemical Microscopy, SECM)을 이용하여 산소 농도 분포를 각각 측정하였다. 한우 체내수정 란의 산소 소비량(10¹⁵/mol s— 1)을 측정하고 이를 수란우에 이식한 후 수태율을 조사한 결 과 산소 소비량이 가장 높은 12.0 이상에서 85.7%의 높은 수태율을 나타내었다. 이에 반 하여, 10.0 미만의 낮은 산소 소비량에서는 흥미롭게도 수태율이 0.00%를 나타내었다. 이런 결과들은 형태학적 등급이 좋을수록 수정란의 산소 소비량도 높아진다는 보고를 근 거하여, 산소 소비량이 높은 수정란을 이식하면 수정란이식 수태율이 높아진다는 것을 확인하였다.

본 연구는 사양관리 변경에 따른 혈중 주요성분 분석과 수태율과의 상관관계를 분석하고 자 수행되었다. 연구자가 관리하고 있는 횡성 관내의 1 농가를 대상으로 한우 암소 사양관 리 변화와 인공수정 수태율을 조사하면서 얻은 자료를 동일기간 내 번식우의 혈액으로터 분석한 혈중 MPT 결과와 비교분석하였다. 분석에 이용된 농가는 연구자가 5년 이상 인공 수정 업무와 사양관리 컨설팅을 수행하고 있는 농가로 최근 3년간 평균 이상의 인공수정 수태율을 나타내었지만 2017년 중반기 사양관리 형태의 변경으로 인한 급격한 인공수정 수태율 저하를 겪은 농가이다. 조사기간은 2017년 1월부터 2017년 11월까지이며 최근 3년 간 동일한 사양관리 형태를 유지하였던 2017년 5월까지의 기간 중 2016년부터 2017년 5 월까지의 조사결과를 대조군(67두)으로 사용하였으며, 사양관리 형태를 변경하였던 2017년 6월부터 2017년 11월까지의 결과를 실험군(25두)으로 사용하였다. 조사항목으로 수태율 관 련 인자는 평균 인공수정횟수, 평균 공태기간, 평균 발정주기, 인공수정 수태율 자료를 조 사하였고 혈중 MPT 분석은 AST, GGT, Glucose, Cholesterol, BUN, NEFA 항목을 조사하 였으며 급여되는 사료의 섭취량 또한 조사하였다. 실험결과, 사양관리는 대조군 농후사료 2～3 kg+건초 무제한+사일리지 2～3 kg/일, 실험군 농후사료 3 kg+오차드글라스 3 kg+혼 합건초 3 kg/일의 형태로 이루어졌다. 대조군과 실험군의 혈중 MPT 분석결과 NEFA 160.9±12 및 75.3±39 uEq/L, Glucose 60.1±8.2 및 89.4±10.7 mg/dL, Cholesterol 151.6± 21.1 및 101.9±21.2 mg/dL, BUN 12.8±3.5 및 10.0±6.2 mg/dL, AST 69.6±24.0 및 86.2±12.5 U/L, GGT 19.6±8.0 및 17.7±7.1 U/L로 확인되었다. 또한 건물, TDN 및 단백질 섭취량은 건물 6.87 및 8.05 kg, TDN 3.83 및 5.59 kg, 단백질 0.67 및 0.9 kg으로 조사되 었다. 인공수정 수태율 조사결과 대조군과 실험군에서 87.5±7.9 및 75.1±8.4로 조사되었으 며 수태율 관련인자는 평균인공수정횟수 1.2±0.5 및 2.5±0.4, 평균공태기간(일) 71±8.4 및 90.3±6.5, 평균발정주기(일) 21.4±0.5 및 22.5±0.6으로 조사되었다. 결론적으로 사양관리 형 태의 변경으로 인한 수태율 저하의 원인을 탐색하고자 본 연구가 수행되었으며 사료섭취에 따른 혈중 MPT 분석결과, NEFA의 농도에서 큰 변화가 관찰되었다. 본 연구에서 분석한 농가의 사양관리 형태 변화는 건초의 급여방법이 바뀐 것이 주요한 점으로써, 양질의 조사 료 공급원을 다양하게 유지하여 사양관리의 효율을 높이고자 현장의 여러 농가에서 최근 적용되고 있는 방법이다. 하지만 조사료의 선택과 급여량은 검증된 방법으로 고려되어야 한다. 본 연구결과는 실험두수가 부족하므로 추가적으로 다양한 농가 사양관리 형태의 조 건에서 동일한 실험결과와의 비교분석이 필요하다고 생각된다.

본 연구는 비임신마의 공태기간 단축 등 암말의 번식효율 향상을 위한 기초 연구로서 국립축산 과학원 난지축산연구소에서 제주산마(더러브렛×제주마) 암말의 계절에 따른 난소주기 변화를 분 석하기 위해 실시하였다. 본 연구의 공시마는 국립축산과학원 난지축산연구소에서 사육・보유하 고 있는 제주산마(더러브렛×제주마) 24두를 공시하였으며, 2016년 5월부터 2017년 6월까지 공시 하였다. 암말의 생식기 및 난소 초음파 검사는 주 1회 오전 09:00∼12:00 사이에 실시하였으며, 초음파 진단기를 이용하여 난소 내 난포 및 황체를 확인하였다. 호르몬 분석을 위해 제주산마 24 두를 공시하여 일주일에 2회 채혈하여 호르몬을 분석하였다. 채혈 방법은 오전 9시~11시 사이 heparin 처리된 10 mL vacutainer를 사용하여 경정맥에서 약 10 mL를 채혈하여 곧바로 실험실로 운반하였고, 3시간 이내에 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 분석 시까지 냉동 보존(‒20℃)하였다. 혈중 P4 농도는 의료용면역흡광측정장치(Roche E-170, 스위스)를 이용하여 분석하였다. 말에서의 난소주기형에 대한 정확한 정의는 보고되어 있지 않아 젖소의 난소주기형 정의를 활 용하였다(Shrestha 등, 2004a). 적어도 2번의 연속적인 채혈을 통해 혈액에서 P4 수준이 ≥ 1 ng/mL일 경우, 황체활성을 가지고 있다고 간주하였으며, 배란은 P4 수준이 ≥ 1 ng/mL으로 증가되 기 5일전에 일어난 것으로 분류하였다(Shrestha 등, 2004a). 정상적인 난소주기는 약 2주의 황체 기와 약 1주의 난포기를 보여주는 개체에 대하여 정상적인 주기로 정의하였다. 제주산마의 난소 주기 재개와 관련한 유의성 분석은 SAS program의 Chi-square를 이용하였고, p<0.05 이하의 경 우 유의한 것으로 판단하였다. 공시마 중 13두(61.9%)만이 정상적인 난소주기를 보였으며, 공시마 8두(38.1%)는 난소주기가 지연되는 것을 확인할 수 있었다. 10월에 3두(16.7%), 11월에 5두(27.8%), 12월에 5두(27.8%)가 발정이 정지 되었으며, 나머지 5두(27.8%)에서는 겨울철에도 발정이 지속되는 것을 확인할 수 있 었다. 발정이 정지된 개체는 이듬해 3월까지 발정이 정지되어 있었으며, 비번식계절에도 27.8%는 발정이 지속되었다. 18두 중 4월달에 11두(61.1%), 5월달에 2두(11.1%)가 발정이 재귀되었다. 말의 번식기때 비정상적인 발정주기를 보이는 개체에 대한 기전과 요인은 명확하지 않지만 이 러한 난소주기 이상은 종부 후 수태율에 많은 영향을 미칠 것이며, 또한 비번식계절에 난소주기가 정지된 개체에 대해서도 발정동기화 방법 및 인공조명을 이용한 발정 유기 등 의 방법을 적용하 므로써 번식마의 공태기간을 단축하는 기술 등의 더 많은 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.