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초록

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Bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) is one of important growth factors for skeletal development and bone growth. In this work, BMP-7 was efficiently expressed in recombinant Bacillus subtilis. The mature BMP-7 protein indicated molecular weight of 15.4 kDa by Western blot assay and was secreted into culture medium with 0.35 ng/mL. The extracellular and intracellular rhBMP-7 proteins were purified by using a FPLC system with an ion exchange column and a gel filtration column. The extracellular and intracellular rhBMP-7 proteins had finally a 57.1% purity and a 36.2% purity, respectively. The purified rhBMP-7 proteins showed an intact biological activity which stimulated alkaline phophatase (ALP) activity in MC3T3-E1 cells.

한국어

골 형태 형성 단백질 (bone morphogenetic protein, BMPs) 은 β형 전환 성장인자 (transforming growth factor β, TGF-β) 슈퍼패밀리 (superfamily)에 속하는 펩타이드 성장 인자이 다. BMPs는 포유동물에서 조직 줄기세포 (stem cell)에 작 용하여 골 세포 및 연골 세포로 분화를 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [1]. 그리고 BMPs가 속해있는 β형 전환 성장인자 슈퍼패밀리의 특징은 성숙한 부분 (mature region)에 7개의 시스테인이 매듭을 형성하여 이중합체를 이루는 것이 특징이다 [2]. 1965년 Urist가 여러 종류의 산성 용액으로 탈회한 골 기질을 근육과 피하에 이식하였을 때 이소성 연골이나 골의 분화가 일어난다는 사실을 처음 밝혔 으며 [3], 태생기 또는 그 이후에 미분화 골 형성 전구세포 를 분화시키는 물질을 발견하여 BMP라 명명하였다 [4]. 이후 기능적 생물 검정을 통하여 BMP를 정제하였으며, 분자 클로닝과 재조합된 인간 BMP (rhBMP)의 발현으로 각종 BMP를 발견하여 분류하였다 [5-7]. 지금까지 15종류 의 BMP가 밝혀져 있으며 이 중에서 골 형성을 유도하는 것으로 확인된 것은 5종으로 BMP-2 (BMP-2a), BMP-3 (Osteogenin), BMP-4 (BMP-2b), BMP-6 (human homologue of the murine, Vgr-1), BMP-7 (Osteogenic protein-1)이 Fig. 1. Construction of an expression vector for rhBMP-7 gene. 다 [8-10]. 이들 중 재조합 DNA 기술에 의해 포유류 세포 (CHO cell)로부터 얻어지는 rhBMP-2와 rhBMP-7의 골 유 도능이 가장 우수하다고 보고되어 이를 이용한 연구가 많이 이루어졌으며, 현재까지도 주로 생산되어 연구재료로 사용 되고 있다. 즉, 유전자 재조합에 의해 생산된 rhBMP-2와 rhBMP-7 단백질을 근 골격계 재생에 이용한 임상 연구들 이 보고되었다 [11,12]. BMPs의 재조합 생산은 원핵세포 와 진핵세포의 배양 시스템에서 모두 가능하다. 원핵세포 배양 시스템에서는 포유류 발현 벡터를 통해 완전구조 유전 자 (full-length cDNA)를 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell, CHO cell)에 감염시켜 최초로 rhBMPs 를 생산했다 [13]. 그러나, 포유류 세포로부터 생산되어지 는 rhBMPs는 생산 수율이 낮으며, 중국 햄스터 난소 세포와 아프리카 푸른 원숭이 신장 세포 (COS cell) 시스템을 사용 하여 높은 수준의 BMPs 발현이 어렵다고 보고하였다 [1,14]. 한편, 진핵세포를 이용한 경우 배양 시스템의 구조가 단순 할 뿐만 아니라 배양이 용이하며 다수의 개체를 취급하기 쉬 운 대장균 (E. coli)을 단백질 발현에 많이 사용하였다 [17]. 그러나 대장균을 이용하여 BMPs를 생산하는 경우 봉입체 (inclusion body)의 형성으로 생체 밖 (in vitro)에서 재접힘 (refolding)을 통해 활성형 BMPs로 만들어야하는데, 재접힘 과정이 복잡하고 재접힘 완충용액이 비싼 시약을 포함할 뿐만 아니라 총 수율이 낮은 단점을 가지고 있다 [15-17]. 최근, 외래 단백질의 대량생산을 위한 숙주세포로써 그람 양성균인 고초균 (B. subtilis)이 사용되고 있는데, 고초균은 미국 식품 의약국 (FDA)으로부터 안정성과 내독성이 없는 균 주로 승인 (generally recongnized as safe, GRAS)되었다. 또 한, 고초균은 발현된 단백질을 배양액으로 직접적으로 방출 하기 때문에 세포 파쇄의 과정이 생략되어 단백질 정제가 간 소화되고 세포질에서 봉입체의 형성이 감소됨에 따라 활성형 단백질의 생산이 용이하다 [18]. 이러한 다양한 장점으로 고 초균은 산업규모의 발효에서 유용균주로 사용되고 있다 [19]. 본 연구에서는 고초균을 rhBMP-7 유전자의 발현 시스템 으로 사용하여 rhBMP-7의 발현과 생산에 대한 연구를 하 고자 한다. 그리고, 생산된 rhBMP-7을 정제하고 MC3T3-E1 세포에서 알칼라인 포스파타제 활성도 (alkaline phophatase activity, ALP activity)를 측정함으로써 rhBMP-7의 생물학 적 활성을 조사하고자 한다.

목차

Abstract
 서론
 재료 및 방법
  균주 및 재조합 플라스미드
  재조합 BMP-7 유전자의 제조
  고초균의 형질전환
  재조합 고초균의 rhBMP-7 생산 조건과 배지조성
  rhBMP-7의 정제
  겔 전기영동 (SDS-PAGE)
  웨스턴블로팅 (Western Blotting)
  ELISA
  세포주 (cell-line) 배양
  rhBMP-7 활성의 생물학적 분석
 결과 및 고찰
  rhBMP-7의 염기서열 분석
  rhBMP-7 유전자의 확인
  재조합 고초균에서 rhBMP-7의 생산
  rhBMP-7의 정제와 생물학적 활성
 결론
 REFERENCES

키워드

저자

• 김춘광 [ Chun-Kwang Kim | 전남대학교 물질ㆍ생물화학공학과, 바이오광사업단, 기능성 나노정밀화학사업단 ]
• 오성덕 [ Sung-Duk Oh | 바이오광사업단 ]
• 이종일 [ Jong Il Rhee | 응용화학공학부, 촉매연구소, 바이오광사업단, 기능성 나노정밀화학사업단 ] Corresponding author

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• 간행물명

  KSBB Journal

• 간기

  격월간

• pISSN

  1225-7117

• 수록기간

  2009~2013

• 십진분류

  KDC 476 DDC 576