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초록

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Human ferritin H- and L-chain genes(hfH and hfL) were cloned into the yeast shuttle vector YEp352 with various promoters, and the vectors constructed were used to transform Saccharomyces cerevisiae 2805. Three different promoters fused to hfH and hfL were used: galactokinase 1(GAL1) promoter, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GPD)
promoter and alcohol dehydrogenase I(ADH1) promoter. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting analyses displayed expression of the introduced hfH and hfL. In the production of both ferritin H and L subunits GAL1 promoter was more effective than GPD promoter or ADH1 promoter. Ferritin H and L subunits produced in S. cerevisiae were spontaneously assembled into its holoproteins as proven on native polyacrylamide gels. Both recombinant H and L-chain ferritins were catalytically active in forming iron core. When the cells were cultured in the medium containing 10 mM ferric citrate, the cell-associated concentration of iron was 174.9 μg per gram(dry cell weight) for the recombinant yeast YG-H and 148.8 μg per gram(dry cell weight) for the recombinant yeast YG-L but was 49.4 μg per gram(dry cell weight) in the wild type, indicating that the iron contents of yeast is improved by heterologous expression of human ferritin H-chain or L-chain genes.

한국어

본 연구에서는 유도성 promoter인 GAL1과 상시성 promoter인 GPD와 ADH1 promoter 하류에 사람 ferritin H-chain 유전자(hfH) 및 사람 ferritin L-chain 유전자(hfL)를 연결하여 재조합 plasmid를 구축하고 이들을 S. cerevisiae 2805에 형질 전환시켜 외래 유전자를 성공적으로 발현시켰다. Ferritin 발현에 미치는 promoter의 영향을 비교한 바, 이 두 단백질 생산에 있어서 GAL1 promoter가 GPD나 ADH1 promoter 보다 더 효율적이었다. GAL1 promoter를 사용한 형질 전환체(YG-H와 YG-L)에서 H-chain의 발현율은 전체 수용성 단백질 중 4.5%에 해당하였고, L-chain의 발현율은 9.8%에 이르렀다. 각 균주에서 발현된 H 및 L subunit들은 비변성 젤을 사용한 전기 영동의 결과 대장균에서 생산된 재조합 단백질과 마찬가지로 자발적으로 holoprotein으로 조합되어졌다. 재조합 H-와 L-ferritin들은 단백질 내공에 철을 축적할 수 있음이 Prussian blue 염색으로 확인되었다. 그리고 효모 세포를 10 mM ferric citrate를 함유한 배지에서 배양했을 때, H-ferritin과 L-ferritin을 생산하는 재조합 효모 균주에 있어서의 철의 농도는 각각 174.9 μg per gram(dry cell weight)과 148.8 μg per gram(dry cell weight)이었고 야생형 효모 균주에 있어서의 철의 농도는 49.4 μg per gram(dry cell weight)이었다. 이것은 사람 ferritin 유전자를 효모 균주에 발현시킴으로써 효모의 철 함량이 증진되었음을 유추하는 결과이다.

목차

Abstract
 서론
 재료 및 방법
  사용 균주 및 plasmid
  배지 및 배양 방법
  Ferritin 발현 재조합 plasmid 구축
  효모 형질전환체의 선별과 ferritin의 세포내 발현 효율
  전기영동
  Western blotting
  Atomic absorption spectrometry
 결과 및 고찰
  Ferritin 발현 재조합 plasmid의 구축
  GAL promoter에서의 ferritin 발현에 대한 배지의 영향
  균체 증식과 plasmid 안정성
  효모에서 ferritin H- 및 L-chain의 발현
  Atomic absorption spectrometry
 요약
 REFERENCES

키워드

저자

• 서향임 [ Hyang-Yim Seo | 전북대학교 자연대 생물과학부 및 유전공학 연구소 ]
• 전은순 [ Eun-Soon Jeon | 전북대학교 자연대 생물과학부 및 유전공학 연구소 ]
• 정윤조 [ Yun-Jo Chung | 전북대학교 자연대 생물과학부 및 유전공학 연구소 ]
• 김경숙 [ Kyung-Suk Kim | 전북대학교 자연대 생물과학부 및 유전공학 연구소 ] Corresponding author

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• 간행물명

  KSBB Journal

• 간기

  격월간

• pISSN

  1225-7117

• 수록기간

  2009~2013

• 십진분류

  KDC 476 DDC 576