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초록

영어

Urokinase (UK), a thrombolytic enzyme used to clear catheters obstructed by blood clots, can be also used industrially in the recombinant protein purification system to cleave a fusion protein linked with a certain fragment of GST. We have immobilized UK by covalent attachment to activated Sepharose 6B-Cl gels and evaluated its performance to cleave a fusion protein of hGH and GST. The Sepharose gels were activated by etherification with glycidol (2,3-epoxypropanol) and further oxidized with periodate resulting in glyceryl-Sepharose gels. After the activation treatment, surface density of the aldehyde groups was 7-30 μmol-aldehyde/mL-gel. Immobilization yield was higher than 99% at high pH (10.5), and the immobilized UK maintained ca. 80% specific activity of the soluble UK. In a column reaction the cleavage yield heavily depended on the feed rate, and it was nearly 86% of that from soluble UK. And the immobilized UK was successfully regenerated by unfolding and refolding with 6M GuHCl. After cleavaging reaction, the monomeric hGH was purified by using expanded bed adsorption chromatography.

한국어

본 연구에서는 고정화 UK를 이용한 융합단백질의 절단반응에 대해 UK의 고정화, 고정화 UK의 특성과 절단반응, 절단반응 후의 분리정제 그리고 고정화 UK의 재생에 대해 실험하였다. 고정화 수율은 99% 이상이였고 고정화 후의 효소활성은 80%를 유지하였다. 융합단백질 전단반응에서 액상 UK와 고정화 UK를 이용한 회분식 반응 모두 약 70%의 절단반응을 얻었고, 특히 고정화 UK의 사용시 부반응이 매우
낮은 이점이 있었다. 컬럼식 절단반응에서는 기질의 주입속도에 따라 절단수율은 크게 변화하였다. 최적의 유속은 50%의 절단수율을 얻은 1 bed volume/h로 설정하였다. 고정화효소반응의 이점인 안정성과 반복사용 측면에서는 액상 UK 대비 고정화 UK가 높은 열안정성을 보였고 낮은 pH에서는 10% 이상 높은 활성을 유지하였다. 반복사용을 위해 6MGuHCl을 사용하여 인위적으로 풀림, 재접힘을 한 경우 98%의 활성을 얻음으로 타당성이 있음을 제시하였다. 또한 목적단백질의 분리를 위하여 산침전 후 expanded bed adsorption 크로마토그래피를 이용함으로써 연속화된 고수율의 정제공정을 가능하게 하였다. 이러한 고정화 UK를 이용한 절단반응 및 정제시스템을 구축함으로써 융합단백질의 생산공정에 매우 유용하게 사용될 것으로 생각되어진다.

목차

Abstract
 제목없음
 서론
 재료 및 방법
 실험재료
  Sepharose gel의 활성화
  UK의 고정화
  UK 효소역가분석
  융합단백질 절단반응 평가
 결과 및 고찰
  Sepharose gel의 활성화
  UK의 고정화
  고정화 UK의 특성
  액상 UK의 융합단백질 절단반응
  고정화 UK의 회분식 절단반응
  고정화 UK의 컬럼 반응기에서의 연속식 절단반응
  Expanded bed adsorption 크로마토그래피를 이용한 hGH단량체의 분리
  고정화 UK의 풀림과 재접힘을 통한 반복사용
 요약
 감사
 REFERENCES

키워드

저자

• 서창우 [ Chang Woo Suh | 한양대학교 화학공학과 생물공정연구실 ]
• 강관엽 [ Kwan Yub Kang | 재)목암연구소 단백질 연구실 ]
• 이효실 [ Hyosil Lee | 재)목암연구소 단백질 연구실 ]
• 안상점 [ Sang Jum Ahn | (주)녹십자 GE팀 ]
• 이은규 [ Eun Kyu Lee | 한양대학교 화학공학과 생물공정연구실 ] Corresponding author

참고문헌

발행기관

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• 간행물명

  KSBB Journal

• 간기

  격월간

• pISSN

  1225-7117

• 수록기간

  2009~2013

• 십진분류

  KDC 476 DDC 576